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日期20020611添加剂名称饲用酶制剂
副类别开发中的饲料添加剂评述类别饲料添加剂
资料来源中国饲料数据库情报网中心
内容饲用酶制剂
(一)概况
1.酶的特性酶是生物催化剂,几乎参与所有生命过程的活动。酶的催化效率极高,在可比条件下,大约是化学型催化剂的107~1013倍。酶本身基本上是蛋白质,主要由氨基酸组成,在各个酶的活性部位,氨基酸侧链群有不同的三维结构,由于不同酶的三维结构不同,可催化的反应也就不同,因而酶具有高度的专一性。酶只能与一种或一类底物起催化反应,有的底物或形成有立体异构体时,酶只选择性地催化某种异构体。例如L-谷氨酸脱氢酶只对L-谷氨酸起作用,而不对D-谷氨酸起作用。 2.酶的命名和分类酶的命名原则上是依它所催化的反应,即在它催化的底物名称或反应类别后加上“酶”(-ase)字,按催化反应酶可分为: (1)氧化还原酶:催化氧化还原反应,又分为脱氢酶和还原酶等。 (2)转移酶:催化功能基团转移反应,例转氨酶等。 (3)水解酶:催化水解反应,当水解不同链时,又可分为酯酶、糖酶、蛋白酶、肽酶等。 (4)裂解酶:催化裂解反应。 (5)异构酶:催化异构反应。 (6)合成酶:催化合成反应。 3,酶催化反应的过程催化反应分两步,首先酶(E)和底物(S)形成酶一底物复(络)合物(ES),然后进行化学反应;生成的产物(P)从酶 的活性部位解析下来,酶又可重新作用。2个过程都是可逆的,而且是在于定条件下处于动态平衡状态。 E+S→ES→P+E 由于ES的形成,使底物的反应键变形(或极化),并且被固定在酶的活性部位,使底物与反应基团接近,把分子间的反应变成分子内的反应。再加上多功能集团的协同,使反应加速。温度会加速上述平衡的形成,因而温度对酶催化反应有极显著的影响,随着温度的上升而反应加快。但是高于40℃后,由蛋白质组成的酶会变性而失活。因而当pH、酶纯度和作用时间在一定的条件下,每种酶只在一定温度下有最大活力,此温度为该酶作用的最适宜温度。动物组织中的酶,最适温度一般在35~40℃,但这是相对的。如酶在干燥状态时对温度的耐受力高;细菌α-淀粉酶加入CaCl2会增加热稳定性。pH、酶纯度,作用时间等其他条件改变时,最适作用温度也会变化。 同样每种酶也具有活力最大的最适pH(常见水解酶的最适PH表)。改变pH可明显改变反应方向。在考虑pH影响时,酶、底物和系统中其他组分的解离状态都不可忽视。酶具有许多可解离的基团(一COOH、一NH2等),有的基团在非解离状态下才有活性,而有的则是在离子状态下才有活性。因而胃和肠道等部位的pH对于酶活力是很重要的条件。 如果反应体系中存在底物的类似物,它与酶结合形成EI,以致抑制催化反应,此类似物称为抑制剂(1)。若抑制剂与全部酶结合且不可逆时,酶就会失活。例金属离子pb2+、Hg2+对琉基酶的抑制,有机磷农药对胆碱酯酶的抑制,氰化物对某些金属酶的抑制等。动物体中的酶失活时,
常见水解酶的最适PH表
酶促反应停止。动物表现出中毒症状。大豆中存在胰蛋白酶抑制剂,可使蛋白质消化率降低,动物胰腺肥大,含硫氨基酸的内源性损失多。要经加热处理使之失活,大豆才适宜作饲料。 也有些金属离子和有机物与酶或底物结合后生成EMS,有利于底物和酶活性部位的催化基团结合,从而提高酶活力,这些物质称为举活剂(M)。例如酵母磷葡萄糖变位酶可催化1-磷酸葡萄糖转化成6-磷酸葡萄糖,当[Mg2+]=0时,酶活力只有15%,[Mg2+]=1×10-3~3×10-3mol/L时活力最大,但是这是相对的,若[Mg2+]再增加时,则反而会抑制酶活,此作用可由Zn2+代替Mg2+。金属离子之间也会有拮抗,Na+抑制K+,Ca2+抑制Mg2+的激活作用。有机物的激活剂可以是小分子的,例如抗坏血酸或半胱氨酸可激活木瓜蛋白酶等;但也有的是大分子的,例如无活性的羰肽酶原A(分子量约95000)需要胰蛋白酶激活成羰肽酶A(分子量约为34000)才有催化活性就是一例。这些有机物也称为辅因子或辅酶。 在酶的提取或纯化过程中,激活剂往往会丢失,应注意补充。在酶制剂的生产过程中应避免引入抑制剂。 4.酶制剂在饲料添加剂上的应用将“酶”添加到饲料中提高饲料营养价值和畜禽生产性能的设想和实践,已有数十年的历史。早在20世纪50年代,Jensen等(1957)和Fry等(1958)曾报道,添加粗制淀粉酶和蛋白酶制剂到大麦日粮中,可显著提高鸡的生长速度和饲料转化率。早期是从大麦芽中得到淀粉酶,以后用动物来源的胃蛋白酶和胰蛋白酶;植物来源的木瓜蛋白酶(papain);从枯草杆菌中制得了β-葡聚糖酶;曲霉中制取了植酸酶等。但在相当长的历史时期内,由于生产成本高、活性低、稳定性差等问题,一直未能进入实用阶段。20世纪90年代前后,由于生物工程特别是酶工程的迅猛发展,生产成本下降,活性和稳定性大幅度提高。到了20世纪末,在全世界范围内,霉制剂在配合饲料中的用量都有极大增加。在中国,除了进口产品外,近年来也开发出各种饲用霉制剂,并已进入饲料市场。近年来,国内外大量的饲养试验和消化代谢试验都充分证明添加各种饲用酶制剂不仅能有效地消除饲料抗营养因子的有害作用,而且能全面促进养分的分解消化和吸收利用,提高畜禽的生长速度、饲料转化效率和增进畜禽健康。不仅如此,在应用各种酶制剂提高氮、磷利用率的同时,还可减少养殖业排污中的氮、磷排放水平。因此,应用饲用酶制剂已成为现代化养殖业中经济效益与生态效益兼顾的重要科学技术措施。 目前商品饲用酶制剂一般均为复合酶制剂,单一酶制剂只有植酸酶一种。构成饲用酶制剂的酶一般属于水解酶类中的水解糖苷酶、水解酯酶等的亚类。其中最具应用价值的酶有: 植酸酶(phytase);蛋白酶(protease);淀粉酶(amylase),其中包括:α-淀粉酶(α-amylase)、支链淀粉酶(pullulanase)等;非淀粉多糖酶(NSP enzymes),其中包括:木聚糖酶(xylanase)、β-葡聚糖酶(β-glucanase)、纤维素酶(cellulase)、甘露聚糖酶(man-nase)、果胶酶(pectinase)等;寡聚糖酶(oligosaccharide enzymes),其中包括:β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)等;脂肪酶(Lipase);酯酶(esterase)和环氧酶(epoxidase)。 复合酶制剂由1种或几种酶为主体及少量其他酶而构成。酶的降解作用具有高度的选择性和专一性,不同的酶降解底物不同,复合酶制剂可以同时降解饲粮中多种抗营养因子和养分,从而从整体上提高饲料的营养价值。 (二)饲用酶制剂的来源和生产工艺 饲用酶制剂一般来源于微生物,由木霉、曲酶、枯草杆菌等微生物发酵培养生产。 目前饲用酶制剂微生物发酵生产的常规工艺是: 1、菌株选育筛选具有分泌需要酶的微生物菌株,如木霉分泌木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶等;曲霉分泌植酸酶、α-淀粉酶、蛋白酶等。通过诱变或基因重组技术可获得高产菌株。基因重组技术将编码特定酶的DNA(cDNA)分离,体外构建成高效表达载体,然后转移到能以较低成本、大规模发酵生产的微生物内,从而表达出高水平的酶来。Ward等(1993)报道,近年来,在曲霉属的丝状真菌(Aspergillus)的表达系统方面取得成功,通过这一系统植酸酶等被表达出来,提高产酶水平。同时可利用细胞杂交技术和原生体融合技术,生产杂交酶,对父母本中的特性进行扬长避短。Simon等(1993)报道,从离析芽孢杆菌(B.macerans)中可获得芽孢杆菌--β-葡聚糖酶,具有热稳性,但不耐酸,而从淀粉凝解芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)中获得的--β-葡聚糖酶性质则相反。因此,将两种来源的基因切成不同长度的片段移人大肠肝菌转化区进行重组,即可筛选出一种既具有抗酸性又具有抗热性的β-葡聚糖酶。 2、发酵培养通过培养基成分和培养条件的变化,调整分泌酶的活性,进行发酵。 3、酶的提取包括发酵液过滤、酶液浓缩、盐析或有机溶剂沉淀、干燥、粉碎、载体吸附、稀释分装等。发酵法生产的酶制剂产品本身含有多种酶活性,故为复合酶制剂。 在发酵法生产的酶制剂产品的基础上增加一些其他的有用酶成分,又可形成一种新的复合酶制剂。Leslie(1996)曾称复合酶制剂为酶的“鸡尾酒”。 饲用酶和其他酶一样,其活性受许多因素的影响,如作用pH、温度、时间、水分、抑制剂、激活剂、底物浓度、产物浓度、贮存时间等。 (三)饲用酶的应用效果及其作用机理 1.植酸酶植酸盐又称肌醇-6磷酸盐,存在于谷物、豆类和油料作物中。植酸盐中的磷又称植酸磷。谷物、豆类和油料作物中约含有1%~2%的植酸磷,植酸磷约占饲料总含磷量的60%~80%。植酸盐非常稳定。由于单胃动物自身不分泌能分解植酸盐的植酸酶,故植酸磷基本上不能被单胃动物所利用。 植酸酶属于磷酸单酯水解酶,为磷酸酶的一种。植酸酶可催化植酸盐的水解反应,使植酸盐中的磷以磷酸根的形式游离出来,从而被单胃动物所吸收利用。微生物和植物子实中都存在植酸酶(若干饲料中的植酸酶活性表)。
若干饲料中的植酸酶活性表
①PTU/g:植酸酶的活力单位,定义为:在pH5.0 37℃条件下,每克样品每分钟从植酸钠释放的无机磷nmol数(Alko法)。
微生物植酸酶为肌醇六磷酸3-磷酸水解酶,简称3-植酸酶。3-植酸酶水解植酸盐时,首先从肌醇的第三位碳原子上催化释放磷酸根,然后依次催化释放其他碳原子上的磷酸根。植物植酸酶为肌醇六磷酸6-磷酸水解酶,简称6-植酸酶。6-植酸酶首先从肌醇的第六位碳原子上催化释放磷酸根,然后依次催化释放其他碳原子上的磷酸根。小麦、大麦、黑麦及其加工副产品中存在较高活性的植酸酶,而玉米、饼粕类饲料中植酸酶活性很低,甚至无植酸酶活性。植物植酸酶一般不适宜在饲料中添加使用,一方面其适宜pH范围较高,为5~7.5,不能在胃中较低pH环境下起作用,另一方面植物植酸酶往往易于被过多的产物所抑制。而微生物植酸酶不存在上述缺点,基因重组微生物植酸酶和底物作用时有3个活性高峰,分别为pH2.8、4.5和6.5,因而具有适应畜禽消化道各种pH环境的能力。 Nelson等(1968)首次报道,由黑曲霉(Asp.ficuum)发酵产生的微生物植酸酶能够提高肉鸡对大豆粕中植酸磷的利用率。由于当时的微生物植酸酶生产成本高,活性低,因而植酸酶的研究和应用在相当长的一段时间内未引起人们广泛重视。随着生物技术和发酵工艺的发展,发达国家环保意识的提高,20世纪80年代植酸酶的研究和应用重新被提 到议事日程上来。目前微生物植酸酶已在西欧和各国广泛地用于畜禽生产。姚斌、范云六等(1998)从土壤中筛选到产植酸酶的黑曲霉菌株(Aspergillus niger 963),从这种霉菌中克隆了植酸酶基因,经分子改造后,利用生物反应器毕赤酵母高效表达出了植酸酶基因。植酸酶在基因工程中的表达量达到8X10?PTU/ml发酵液,可与这项技术已与国内有关企业合作投入生产。 Lynch(1996)报道,产蛋鸡日粮中添加300~600PTU/kg植酸酶,可达到与添加无机磷相同的效果。因而完全取代产蛋鸡日粮中的无机磷源。Jongbloed等(1992)、Beers和Jongbloed(1992)、Morz等(1993)、Beers(1992)、Kemme和Jongbloed(1993)和Dekker等(1992)都前后报道,猪饲料中添加植酸酶也可提高总磷和钙的消化率(表添加植酸酶对猪饲料总磷和钙消化率的影响)。近年来,在国内也有试验证明,在产蛋鸡日粮中添加300PTU/kg植酸酶日粮就能达到与添加1.3%磷酸氢钙相同所饲养效果。
添加植酸酶对猪饲料总磷和钙消化率的影响
植酸酶有以下几方面的应用效果: (1)由于总磷消化率提高,可减少磷对环境的污染。Summers(1992)指出,家禽粪尿中磷的排出量占其摄人量的75%左右。畜禽粪尿磷的大量排放严重污染水体,降低水中的含氧量,导致嗜磷藻类的异常生长,严重破坏生态环境。Leslie(1996)指出,日粮中添加植酸酶可使畜禽粪尿中含磷量减少约30%。添加植酸酶使畜禽粪尿磷对周围环境的污染程度减轻40%以上。 (2)提高畜禽日增重和饲料转化率。Simons等(1990)报道,畜禽的低磷日粮中添加植酸酶可显著提高其生产性能。 (3)使被饲粮中被植酸螯合的锌、铜、铁、锰等微量元素及蛋白质释放,提高这些养分的利用率。 (4)避免饲料中由于添加高氟磷酸氢钙等伪劣产品造成的危害。饲料级磷酸盐质量参差不齐,往往可能存在因氟超标而引起畜禽的氟中毒,而使用植酸酶则可避免上述危害,减少不必要的经济损失。 (5)充分利用饲料本身含有的磷资源,节约无机磷资源。 (6)降低饲料成本。如在蛋鸡饲粮中添加植酸酶部分或全部替代加入的无机磷盐,蛋鸡生产性能不变,饲料成本下降。Cromwell等(1993)指出,在肉鸡和猪的饲粮中添加植酸酶也可替代部分无机磷盐。随着今后技术的进步和植酸酶生产成本进一步降低,饲粮中添加植酸酶可望比添加无机磷盐更便宜。 2.非淀粉多糖酶非淀粉多糖(NSP)由不溶性非淀粉多糖及可溶性非淀粉多糖(SNSP)两部分构成(见第八章第一节)。饲料中添加非淀粉多糖酶的应用效果及其作用机制如下: (1)提高畜禽采食量、生长速度和饲料转化率:鸡、猪日粮中添加非淀粉多糖酶,可显著提高采食量、生长速度和饲料转化率(鸡、猪日粮中添加非淀粉多糖酶对饲料转化率的影响)。
鸡、猪日粮中添加非淀粉多糖酶对饲料转化率的影响
汪儆等(1997)报道,20~57kg的生长育肥猪在含40%次粉日粮中添加木聚糖酶制剂,日增重提高8.1%,饲料转化率提高4.3%,腹泻频率减少90%。添加非淀粉多糖酶提高猪、鸡生产性能等作用机制目前主要有两种解释。 第一种解释是非淀粉多糖酶可切割麦类饲料及其加工副产品中的SNSP含量高,黏度大,可吸收大量的水分,从而导致消化道中食糜黏度大为增加。Bedford(1996)指出,食糜黏度的增加使养分从日粮中溶出的速度减缓,降低养分和内源酶的相互作用,养分的消化速度随之减缓。食糜黏度的增加还使养分向肠黏膜扩散的速度减缓,因而吸收率降低。Danicke(1995)指出,食糜黏度的增加使肠道机械混合内容物的能力减弱,脂肪乳化作用减缓,脂肪消化率下降。同时,食糜水分增加,排空速度减慢,促进后肠道微生物发酵,养分利用率降低。De Silva等(1983)指出,加入非淀粉多糖酶可把SNSP切割成较小的分子,使之黏度大为降低,食糜的黏度随之也大大降低,从而可提高麦类饲料及其加工副产品日粮中所有养分的消化率和利用率。Juokslahti等(1996)报道,在肉鸡黑麦日粮中添加木聚糖酶,肠道内容物上清液的黏度大幅度下降,从而可增加黑麦在配合饲料中的比例。由于可大幅度增加大麦、黑麦等相对廉价的原料在饲料配方中的比例,添加非淀粉多糖酶给饲料和养殖企业配制最低成本平衡日粮提供了灵活性。 第二种解释是非淀粉多糖酶可裂解植物性饲料的细胞壁,提高各种类型饲粮的利用率。因为单胃动物不分泌非淀粉多糖酶,用添加的非淀粉多糖酶降解NSP,裂解细胞壁,有利于细胞中的淀粉、蛋白质和脂肪等养分从细胞中释放出来,使之充分和消化道中的内源酶作用,从而提高饲料能量和养分的消化率,进而提高畜禽生产性能。 非淀粉多糖酶还可水解细胞壁中一些碳水化合物一蛋白质键,释放这一部分蛋白质,提高饲料蛋白质利用率。 (2)减少畜禽肠道疾病:Inborr(1988)指出,某些非淀粉多糖酶,如甘露聚糖酶可将豆类饼粕中的甘露聚糖降解成甘露寡糖,甘露寡糖可和某些肠道致病细菌结合,从而减少畜禽肠道疾病,如仔猪腹泻等。 (3)增进畜禽健康:Choct(1996)指出,添加非淀粉多糖酶使NSP水解,NSP降解产物在小肠被吸收,NSP进入后肠道数量减少,因而后肠道微生物增殖减少,黏粪减少,空气中氨气和硫化氢的浓度降低,垫料湿度也降低,保持地面干燥,改善饲养环境卫生,增进畜禽健康,提高畜禽的成活率。韩正康(1996)报道,在雏鸡大麦日粮中加入以?-葡聚糖酶为主的粗酶制剂,显著提高了禽体细胞免疫力。 (4)减少脏蛋:添加非淀粉多糖酶,减少家禽饮水量和粪便含水量,泄殖腔污染减少,脏蛋减少,提高了蛋的商品价值。 (5)使畜禽体重均匀:Choct等(1995)指出,小麦中NSP含量变异较大,AME变异也较大,添加非淀粉多糖酶可使之达到相同水平,可使家禽体重均匀。 (6)减少环境污染:Donham(1995)指出,添加非淀粉多糖酶可减少畜禽粪便有机物和氮的排泄量,可减少有机物和氮对环境的污染。 3.寡聚糖酶豆粕中除含有NSP、胰罩白酶抑制因子、植物凝集素等抗营养因子外,还含有7.1%寡聚糖-α-半乳糖苷(α-galactosides),其中包括棉籽糖(1.9%)和水苏糖(5.2%)。Gitzelmann和Auricchio(1965)报道,鸡小肠黏膜不分泌α-半乳糖苷酶。α-半乳糖苷因此进入后肠道,通过微生物发酵形成挥发性脂肪酸。Leske等(1993)报道,在寡聚糖被提净的豆粕日粮中加入棉籽糖和水苏糖后真代谢能和干物质消化率显著下降。 添加α-半乳糖苷酶可使豆粕中的α-半乳糖苷在小肠前部水解为单糖,而直接被利用,提高代谢能值,同时减少α-半乳糖苷直接进入后肠道可能引起胃胀的气体,如C02、CH4和SH2等。Vila等(1999)报道,在豆粕一玉米日粮中加入500μg/kg和750μg/kg的α-半乳糖苷酶后,其代谢能值分别为14.90MJ/kg和14.55MJ/kg,比对照组的13.84MJ/kg约高出5%以上,氮存留率分别为45.7%和48.8%,比对照组的41.3%高出15%以上。由此说明豆粕日粮中添加α-半乳糖苷酶不仅有利于提高能量的利用效率,还有利于提高蛋白质的利用效率。 4.淀粉酶和蛋白酶Lindemann(1986)指出,单胃动物自身分泌淀粉酶和蛋白酶,但幼禽幼畜消化机能尚未健全,淀粉酶、蛋白酶分泌量不足。在其日粮中添加外源淀粉酶、蛋白酶,不但能补充体内内源酶的不足,而且能激活内源酶的分泌,因而有利于畜禽这一阶段对淀粉和蛋白质的消化分解和吸收利用。添加支链淀粉酶可降解在饲料加工中形成的结晶化淀粉,提高淀粉的消化率。添加枯草杆菌蛋白酶可降解豆类抗营养因子胰蛋白酶抑制因子、植物凝集素和抗原性蛋白质等,从而提高饲料蛋白质的消化率和存留率。日粮中添加外源淀粉酶、蛋白酶,可加快十二指肠和回肠前部对淀粉、蛋白质的消化吸收, 从而减少后肠道微生物对营养物质的消耗。 5.脂肪酶Lyons(1996)和Moughan(1996)报道,脂肪酶可提高饲料中的脂肪消化率,特别可显著提高米糠中的脂肪消化率,因而可明显提高米糠的表观代谢能值。 6.酯酶和环氧酶某些酯酶和环氧酶,能降解饲料中的霉菌毒素,如玉米赤酶烯酮(zearalenone)和所有的单端孢菌素(trichothecenes),包括T-2毒素,呕吐毒素(deoxyni-valen01),瓜萎镰菌醇(nivalen01)等,而降解产物无毒无害。Paste-nuner(1997)指出,酯酶可裂解玉米赤酶烯酮的内酯环,环氧酶则可裂解单端孢菌素的12,13-环氧基,生成无毒的降解产物被消化或排出体外。 (四)饲用酶制剂的生产工艺及产品开发 饲用酶制剂一般由3个部分组成,即酶、载体和包被物质组成(图:包被微囊酶制剂的横断面示意图)。
包被微囊酶制剂的横断面示意图
由于酶是蛋白质,加热会使其三维结构变形,虽然酶在干燥条件下,90C加热30min不会失活。但在相同温度下供给蒸汽,就会迅速失活。在65℃调节温度制粒时,吸附到载体上的酶是十分稳定的。75℃制粒时,酶的活性就有一定程度的下降。Bustany(1996)指出,肉鸡粉料加酶提高生产性能的幅度大于肉鸡颗粒料加酶。Gadient等(1993)指出,制粒引起酶活损失的程度和酶制剂的类型、制粒工艺有关。如将酶进行“包被”,酶的热稳定性就有所提高。如制粒温度超过85℃,就应采用液体酶制剂喷洒到冷却后的颗粒料上,从而避免高温蒸汽对酶活的不利影响。 通过生物工程高效表达的工程菌,经过纯化发酵后可获得活性很高的浓缩酶。经载体稀释到一定水平,成为方便应用的酶制剂产品。但是为了提高酶制剂的稳定性,大部分酶制剂需经过包被处理,制成微囊。一方面是为了防止在配合饲料加工过程中的热、湿、酸、碱等不利因素的破坏,同时也是为了躲过酶制剂在胃液中作为蛋白质被降解而失活。 另一方面,所有酶制剂都具有很强的专一性。因此,所有酶制剂在消化道中与底物的最佳作用环境也是有条件的,为了真正发挥酶制剂的效率,还应通过实际动物饲养试验,弄清外源酶与内源酶的关系,日粮营养水平与酶制剂活力的关系以及产品储存条件与货架寿命的关系等,才能为用户提供全套实用技术指南(酶制剂开发与生产工艺流程简要示意图)。
酶制剂开发与生产工艺流程简要示意图
(五)饲用酶制剂需要进一步研究的问题 1.应用现代生物技术及酶制剂包被技术,进一步提高现有酶制剂酶活及热稳定性。 2.研制开发对各种抗营养因子和饲料毒素具有降解作用的酶制剂。 3.进一步研究复合酶中主酶和次要酶、内源酶与外源酶之间的协同或拮抗关系,提高复合酶的协同效应。 4.建立简易快速的饲料和养殖企业都能应用的体内或离体酶活性测定方法。
负责人熊本海博士



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