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日期20020613名称饲料中维生素含量的测定
副类别维生素饲料添加剂的检验类别饲料质量检验
资料来源中国饲料数据库情报网中心
内容正文 饲料中维生素含量的测定

  (一)饲料和预混合饲料中维生素A的测定

  1.原理:用碱溶液皂化试样,乙醚提取未皂化的化合物,蒸发乙醚,残渣溶于正己烷,用HPLC进行测定。
  2.测定

  (1)皂化:称取配合饲料或浓缩饲料10g,维生素预混料1~5g,置于250ml圆底烧瓶中,加50ml抗坏血酸乙醇溶液,混匀,加入10m150%氢氧化钾溶液混匀,置于沸水浴上回流30min,至皂化结束,分别用5ml乙醇、5ml水自冷凝管顶端冲洗其内部,冷却至约40℃。
  (2)提取:定量转移全部皂化液于盛有100ml乙醚的500m1分液漏斗中,用30~50ml水分2~3次冲洗圆底烧瓶并人分液漏斗中,混合,剧烈振荡2min,静置分层。转移水相至第二个分液漏斗内,分次用100ml、60ml乙醚提取,弃去合并三次乙醚相,用每次100ml水洗乙醚提取液至中性,防止乳化。乙醚提取液通过无水硫酸钠脱水,转移至250ml棕色容量瓶,加100mg BHT使之溶解,用乙醚定容。以上操作均在避光通风柜进行。
  (3)浓缩:分取一定体积乙醚提取液,置于旋转蒸发器烧瓶中,在水浴温度约50℃,部分真空条件下蒸发至干或用氮气吹干,残渣用正己烷溶解(反相色谱用甲醇溶解),稀释至10ml,使其维生素A的浓度为5~10IU/ml,离心或通过0.45ttm过滤膜过滤,清液用于HPLC分析(参见中华人民共和国国家标准GB/T 117817-1999)。
  (二)饲料和预混合饲料中维生素D,的测定
  1.原理:用碱溶液皂化试样,乙醚提取未皂化的化合物,蒸发乙醚,残渣溶于甲醇,净化,蒸发甲醇,残渣溶于正己烷,用HPLC进行测定。
  2.测定
  (1)皂化:称取配合饲料10~20G,浓缩饲料10g,维生素预混料1~5g,置于250ml圆底烧瓶中,加50~60ml抗坏血酸乙醇溶液,混匀,加入10ml 50%氢氧化钾溶液,混匀,置于沸水浴上回流30min,至皂化结束,分别用5ml乙醇、5ml水自冷凝管顶端冲洗其内部,冷却至约40℃。
  (2)提取:定量转移全部皂化液于盛有100ml乙醚的500m1分液漏斗中,用30~50ml水分2~3次冲洗圆底烧瓶并人分液漏斗中,混合,剧烈振荡2min,静置分层。转移水相至第二个分液漏斗内,分次用100、60ml乙醚提取,弃去合并3次乙醚相,用10%氯化钠100ml水洗乙醚提取液至中性,防止乳化。乙醚提取液通过无水硫酸钠脱水,转移至250ml棕色容量瓶,加100mg BHT使之溶解,用乙醚定容。以上操作均在避光通风柜进行。
  (3)浓缩:分取一定体积乙醚提取液,置于旋转蒸发器烧瓶中,在水浴温度约50℃,部分真空条件下蒸发至干或用氮气吹干,残渣用正己烷溶解(需净化时用甲醇溶解),稀释至10ml,使其维生素D3的浓度为2~10μg(80~400IU)/ml,离心或通过0.45μm过滤膜过滤,清液用于HPLC分析(参见中华人民共和国国家标准GB/T17818-1999)。
  (三)饲料和预混合饲料中维生素E的测定
  1.原理:用碱溶液皂化试样,乙醚提取未皂化的化合物,蒸发乙醚,残渣溶于甲醇,净化,蒸发甲醇,残渣溶于正己烷,用HPLC进行测定。
  2.测定
  (1)皂化:称取配合饲料或浓缩饲料10g,维生素预混料1~5g,置于250ml圆底烧瓶中,加50ml抗坏血酸乙醇溶液,混匀,置于水浴上加热、混合至沸点,用氮气吹,冷却,加入10ml 50%氢氧化钾溶液,混匀,在氮气流下沸水浴皂化回流30min,至皂化结束,分别用5ml乙醇、5ml水自冷凝管顶端冲洗其内部,冷却至约40℃。
  (2)提取:定量转移全部皂化液于盛有100ml乙醚的500m1分液漏斗中,用30~50ml水分2~3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗中,混合,剧烈振荡2min,静置分层。转移水相至第二个分液漏斗内,分次用100ml、60ml乙醚提取,弃去合并3次乙醚相,用每次100ml水洗乙醚提取液至中性,防止乳化。乙醚提取液通过无水硫酸钠脱水,转移至250ml棕色容量瓶,加100mg BHT使之溶解,用乙醚定容。以上操作均在避光通风柜进行。
  (3)浓缩:分取一定体积乙醚提取液,置于旋转蒸发器烧瓶中,在水浴温度约50℃,部分真空条件下蒸发至干或用氮气吹干,残渣用正己烷溶解(反相色谱用甲醇溶解),稀释至10ml,使其维生素E(d1-α-生育酚)的浓度为50~1001μg/ml,离心或通过0.45μm过滤膜过滤,清液用于HPLC分析(参见中华人民共和国国家标准GB/T17812-1999)。
  (四)饲料和预混料中硫胺素含量的测定
  1.原理 硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成硫色素,在紫外线下发出荧光。其荧光强度与试样中的硫胺素含量成正比。
  2.步骤
  (1)提取:精确称取一定量试样(饲料或浓缩饲料1~2g,约含硫胺素4~20μg,维生素预混料0.25~0.5g),置于100ml容量瓶中,加入65ml 0.1mol/L盐酸使其溶解,沸水浴加热水解30min,不时摇动。
  冷却容量瓶至50℃以下,加5ml淀粉酶悬浮液,摇匀。调其pH为4.0~4.5。于45~50℃恒温箱中保持3h,冷却至室温,调pH为3.5,定容至100ml,然后混匀过滤,即为提取液。
  (2)净化:吸取25ml提取液使通过制备好的活性人造吸附柱,用每份5ml近沸水洗柱3次,弃去洗液。分3次连续加入25%酸性氯化钾(温度为60~70℃)25ml,收集洗脱液于25ml容量瓶内,冷至室温,用酸性氯化钾定容。
  将25ml硫胺素标准工作液加入吸附柱重复1次,得到标准净化液。
  (3)氧化:于A、B 2个反应管中分别加入5ml试样洗脱液,将3ml 15%氢氧化钠溶液加入反应瓶B,将3ml碱性铁氰化钾溶液加入反应瓶A,振摇约15s,然后依次加入15ml正丁醇并加塞,剧烈振摇15s,再同时振摇90s,静置分层。用标准净化液代替试样净化液,重复1次。弃去下层碱性溶液,加入2g无水硫酸钠待测。于激发波长365nm处,并发射波长435nm处测定各管的荧光强度。(参见中华人民共和国国家标准GB/T 14700-1993)。
  (五)饲料和预混料中核黄素含量的测定
  1.原理 核黄素在440nm波长光激发下产生绿色荧光。在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比。在波长525nm下测定其荧光强度。用连二亚硫酸钠将核黄素还原为无荧光的物质,由还原前后荧光强度之差计算其含量。
  2.测定
  (1)样品提取:称取饲料、浓缩饲料1~2g,维生素预混料0.25~0.50g于100ml容量瓶中,加入65ml 0.1mol/L盐酸溶液,于沸水浴加热30min。冷却后用lmol/L氢氧化钠调节至pH为6.0~6.5,然后再用lmol/L盐酸调节至pH4.5,定容至100ml,过滤。
  (2)氧化杂质:吸取10ml样品提取液2份及核黄素标准工作液,分别于20ml的带盖刻度试管中,各管加lml冰乙酸,混匀。加4%高锰酸钾溶液0.5ml,混匀,放置2min。再滴加10%双氧水溶液0.5ml,直至高锰酸钾的颜色褪掉。剧烈振摇此管,使多余的氧气逸出。
  (3)步骤:其中1份样品液和标准液于激发光波长440nm,发射光波525nm,测量样品管及标准管的荧光值。
  另1份样品液加入20mg连二亚硫酸钠,立即混匀,使气体逸出,迅速测其荧光强度值作为空白(参见中华人民共和国国家标准GB/T14701-1993)。
  (六)预混合饲料中维生素B6的测定
  直接荧光分析法。
  (1)原理:样品中添加维生素B6直接用水提取后,在中性条件下采用荧光分析法测定含量。
  (2)测定
  ①样品提取:称取约0.3~0.5g试样,置于l00ml容量瓶中,加水溶解后,定容至刻度,振荡1~2min,静置,或离心10min。
  ②步骤:移取lml上清液,置于25ml容量瓶中,用pH7缓冲液定容至刻度,混匀用lcm石英比色杯,在激发波长(λEX)=326nm、发射波长(λEM)=395nm下测定其荧光强度,同时做空白试验加以校正(参见中华人民共和国国家标准GB/T14702-1993)。
  (七)预混合饲料中维生素B12的测定
  1.原理 用水提取维生素B12,用HPLC进行测定。
  2.测定
  维生素预混料中维生素B12的提取:称取试样2~3g,置于l00ml棕色容量瓶,加约60ml去离子水,在超声波水浴中超声提取10min,用去离子水定容,过滤,滤液过0.45um过滤膜,清液用于HPLC分析。
  维生素B12制剂(1%~2%)的提取:称取试样1s,置于l00ml棕色容量瓶,加约60ml去离子水,在超声波水浴中超声提取10min,用去离子水定容,过滤,吸取lml滤液于50ml棕色容量瓶,用去离子水定容,过0.45μm过滤膜过滤,清液用于HPLC分析(参见中华人民共和国国家标准GB/T 17819-1999)。
  (八)饲料中总抗坏血酸的测定
  1.原理 样品在弱酸条件下提取,其还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸,与邻苯二胺(OPDA)反应生成有荧光的喹嗯啉(quinoxaline),其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比,以此测定中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应,以此作为“空白”排除样品中荧光杂质的干扰。
  2.测定
  (1)试样中碱性物质的预检:称取1g试样,加10ml偏磷酸一乙酸溶液,用百里酚蓝指示剂检查pH,如呈红色,即可用偏磷酸一乙醇溶液作样品提取稀释液;若呈黄色或蓝色,则滴加偏磷酸一乙酸一硫酸溶液稀释,使其变红,并记录所用量。
  (2)试样溶液的制备:称取若干克试样(含抗坏血酸约2.5~l0mg)于100ml容量瓶,按预检碱量,加偏磷酸一乙酸溶液,调pH为1.2,或直接用偏磷酸一乙醇溶液定容,摇匀,必要时过滤,滤液为试样溶液。
  (3)步骤
  ①氧化处理。分别取样品滤液及标准工作液各100ml于200ml带盖三角瓶中,加2g活性炭,用力振摇lmin,干法过滤,弃去最初数毫升滤液,分别收集其余全部滤液,即样品氧化液和标准氧化液,待测定。
  ②各取l0ml标准氧化液于2个100ml容量瓶中,分别标明“标准”及“标准空白”。
  ③各取10ml样品氧化液于2个100ml容量瓶中,分别标明“样品”及“样品空白”。
  ④于“标准空白”及“样品空白”溶液中各加5ml硼酸一乙酸钠溶液,混合摇动15min,用水稀释至100ml,在4℃冰箱中放置2~3h,取出备用。
  ⑤于“样品”及“标准”溶液中各加入5m150%乙酸钠液,用水稀释至100ml,备用。
  ⑥取“标准空白”溶液,“样品空白”溶液,“样品”溶液各2ml,分别置于10ml带盖试管中。在暗室迅速向各管中加入5ml邻苯二胺溶液,振摇混合,在室温下反应35min,于激发光波长350nm、发射光波长430nm处测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标,对应的抗坏血酸含量为横坐标,绘制标准曲线或进行回归计算,其直线回归方程供计算时使用(参见中华人民共和国国家标准GB/T 17816-1999)。
负责人熊本海博士



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