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日期20020613名称饲料中氨基酸含量的测定
副类别氨基酸饲料添加剂的检验类别饲料质量检验
资料来源中国饲料数据库情报网中心
内容正文 饲料中氨基酸含量的测定

  (一)配合饲料、浓缩料及各种原料中的氨基酸含量测定
  1.预处理

  (1)水解,称取约l00mg样品(准确至0.1mg)置于水解管中,加入6mol/L盐酸15ml,将水解管放人液氮中冷冻至少有一半溶液为固体后取出,接在真空泵上抽气减压,当压力至7Pa(≤5×10~2mnl汞柱)后封口。将水解管放人(110±1)℃恒温干燥箱中水解22h。
  (2)取出水解管,冷却,打开水解管,过滤,吸取lml滤液在旋转蒸发器或浓缩器上,45~50℃下减压蒸发至干,残留物加少许水重复蒸干2次,最后加适量柠檬酸钠缓冲液离心,取上清液供测定。
2.测定
(1)准确称取0.5~1.0g样品,加入30ml 0.1mol/L盐酸溶液,振荡30min,过滤,不溶物再分别用20ml 0.1mol/1盐酸溶液,及120ml无离子水提取2次,合并滤液,定容至250ml。
(2)吸取5ml滤液于旋转蒸发器或浓缩器上,真空蒸发至干,加10mlpH2.2柠檬酸钠缓冲液,充分混匀后,取上清液上机。按氨基酸分析仪仪器说明书操作规程进行。
注解:上述酸水解方法适用于除胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸以外的其他15种氨基酸的分析。胱氨酸、蛋氨酸由于在酸水解过程中容易被氧化,测定的值偏低,国际上目前普遍采用在水解前先将样品进行过甲酸氧化,使胱氨酸、蛋氨酸分别氧化成为半胱磺酸、甲硫氧砜,在酸水解时很稳定,水解后单独上机测定。而色氨酸在酸水解时被破坏,目前都采用碱水解的方法,水解后用氨基酸分析仪或液相色谱仪测定。
(二)饲料中含硫氨基酸含量的测定--离子交换色谱法
1.原理 饲料中的含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸)用过甲酸氧化,并经盐酸水解,生成磺基丙氨酸和蛋氨酸砜,此2产物可用离子交换色谱法分离测定。此法适用于单一饲料、配合;(混)饲料及浓缩饲料。
2.测定
(1)样品处理:取具代表性的饲料样品,用四分法缩减分取25g左右,粉碎并过0.45mm孔径筛,充分混匀后装入磨口瓶中备用。
(2)样品的氧化和水解:称取含蛋白质7.5~25mg的试样双份,精确至0.000 18,样品量不超过75mg,置于旋转蒸发器20ml浓缩瓶或浓缩管中,于冰水浴中冷却30min后加入已经冷却的过甲酸(将30%的过氧化氢与88%的甲酸按1:9的比例混合,置冰水中备用)溶液2ml(测定浓缩料或含NaCl大于3%的饲料时,在过甲酸溶液中按3mg/ml加入硝酸银),加液时需将样品全部润湿,但不要摇动,盖好瓶塞,与冰浴一道置于0℃冰箱中,反应16h。
(3)步骤:依使用不同氧化终止剂而不同。若以氢溴酸为终止剂,于各管中加入氢溴酸0.3ml,振摇,放回冰浴,静置30min,然后移到蒸发器或浓缩器上,在60℃,低于3.3×103pa(25mm汞柱)下浓缩至干。用盐酸溶液约15ml将残渣定量转移到20ml安瓿中,封口,置恒温箱中、109~111℃下水解22~24h。也可用6mol/L盐酸溶液约25ml将残渣转移到50ml消煮管中,于水解炉中,(110±3)℃回流水解22~24h。
(4)工作液的制备:取出安瓿或水解管,冷却,用水将内容物定量地转移到50ml容量瓶中,定容。充分混匀,过滤,取1~2ml滤液,置旋转蒸发器或浓缩器中,在低于50℃的条件下,减压蒸发至干。加少许水重复蒸干2~3次。准确加入一定体积(2~5m1)的稀释上机用柠檬酸钠缓冲液振摇,充分溶解后离心,取上清液供仪器测定用。
(5)注意事项

①若以偏重亚硫酸钠为终止剂,则于样品氧化液中加入偏重亚硫酸钠溶液0.5ml,充分摇匀后,直接加入盐酸溶液17.5ml,置107~113℃水解22~24h。
②取出水解管,冷却,用水将内容物转移到50ml容量瓶中,用氢氧化钠溶液中和至pH约2.2,并用稀释上机用缓冲液定容,离心,取上清液供仪器测定用。
③如氨基酸受上机样品液中Na+浓度影响,色谱峰出峰时间漂移过大,则需先将水解液定容过滤,而后取2~5ml滤液,于50℃下,减压蒸发至约0.5ml(切勿蒸干),用稀释上机用缓冲液将其转移到10ml容量瓶中,加氢氧化钠溶液调至pH 2.2,并用稀释上机用缓冲液定容。混匀,离心,取上清液供仪器测定用。
④测定浓缩料或含NaCl量大于3%的饲料时,首先应测定其NaCl含量,在氧化剂中应加硝酸银。其用量按下式计算:
  CR≥1.454×m×CN
  式中:eR--过甲酸中硝酸银的浓度(mg/m1);
  m--样品质量(mg);
  CN--样品中氯化钠含量(mg/m1)。
(6)上机:用混合氨基酸标准工作液按仪器说明书,调整仪器的操作参数和洗脱用柠檬酸缓冲液的pH,使蛋氨酸砜分辨率达最佳状态(≥90%),注入制备好的样品和氨基酸标准工作液,进行分析测定。每5个样品(即10个单样)为一组,组间插入混合氨基酸标准工作液进行校准(参见中华人民共和国国家标准 GB/T15399-1994)。
(三)饲料中色氨酸含量的测定--分光光度法
1.原理 饲料中蛋白质经碱水解后,降解成多肽和游离的氨基酸,在酸性介质中,氧化剂存在下,色氨酸吲哚环与对二甲氨基苯甲醛反应生成蓝色化合物,在一定范围内颜色深浅与色氨酸含量成正比。此法适用于配合饲料、混合饲料、浓缩饲料和单一饲料中色氨酸的测定。
2.测定
(1)L-色氨酸标准溶液:准确称取25mg色谱纯L-色氨酸于小烧杯中,加少量0.1mol/L氢氧化钾溶液使之溶解,定量地转移到250ml棕色容量瓶中,用水定容,浓度为100bg/ml(此标准溶液在4℃冰箱中保存,1个月内使用,浓度不变)。
(2)选取有代表性的试样,按四分法缩分至200g,粉碎,全部通过0.25mm孔径筛。在索氏提脂器中用乙醚脱脂,并测定粗脂肪含量。将脱脂样品风干后,混匀,装入密封容器内备用。
(3)步骤
①标准曲线的绘制
吸取色氨酸浓度为100μg/ml的标准溶液5ml、7.5ml、10ml、12.5ml、15ml、17.5m1分别置于25ml棕色容量瓶中用水定容,摇匀。溶液浓度分别为20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml。
吸取各浓度溶液lml,分别置于具塞试管中,空白管加lml水。向每支试管内加入氢氧化钾溶液lml,混匀,将试管放入冷水盆中,加5ml对二甲氨基苯甲醛溶液,从冷水盆中取出试管,摇匀,在室温(20~30℃,下同)放置30min。
向上述每支试管内加0.2ml亚硝酸钠溶液,摇匀,室温放置25min。
以空白管调零,在590nm波长下,以lcm光径测定各溶液吸光度值。
以色氨酸浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制工作曲线,或列出回归方程式。
②工作样制备
称样:根据蛋白质、色氨酸含量称取样品,精确至0.1mg。如蛋白质含量分别为10%~20%、30%~40%、50%以上时,分别取样约0.5g、0.3g、0.16g以上。
水解:将试样置于50ml容量瓶中,在轻轻振摇中缓慢加入25ml氢氧化钾溶液,使试样湿润且不粘壁,置于39~41℃培养箱中水解16~18h。
离心:取出水解液冷却至室温后,用水定容,摇匀,取部分水解液以4000r/min转速离,15min。
显色;取2ml上清液置于具塞试管中,并将试管放人冷水盆中,加5ml对二甲氨基苯甲醛溶液,摇匀。每个试样另取2ml上清液于具塞试管中,加5ml硫酸溶液作为样品空白,摇匀,室温放置30min。然后向每支试管加入0.2ml亚硝酸钠溶液,摇匀,室温放置25min。
比色:以样品空白调零,在590nm波长处lcm光径测定样品溶液的吸光度值。
③分析结果表述:

色氨酸(脱脂样);((A×25) /(m×103))×l00%     (1)
           色氨酸(原样)二((A×25×(1-F)) / (m×103))×100%   (2)
  式中 ITl--脱脂试样质量(mg);
  F p脂肪分率;
  A--从作曲线上查得色氨酸含量(Pg)。
  (参见中华人民共和国国家标准 GB/T15400-1994)
负责人熊本海博士



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