用户名: 密 码:
数据库t2:饲料质量检验另存文本打印浏览 【字体放大】 【字体还原】

日期20020613名称饲料用淀粉酶制剂的活性检验
副类别饲料用酶制剂的活性检验类别饲料质量检验
资料来源中国饲料数据库情报网中心
内容正文 饲料用淀粉酶制剂的活性检验
(一)酸活化淀粉酶的活性检验
1.原理此方法适合于测定从黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和大麦麦芽衍生的酶制剂的淀粉酶活性。应注明的是,此法在霉菌源的酶制剂情况下测定α-淀粉酶及在大麦麦芽制剂情况下测定。α-和β-淀粉酶活性。该测定是以淀粉溶液在(30±1)℃下得到一个标准的水解程度所要求的时间为根据。通过这个水解产物的碘颜色与标准相对比,测定水解的程度。 2.操作步骤移取5ml的碘稀释溶液于一系列13mm×l00mm试管中,将它们置在水浴锅中保持30℃±0.1℃,每次测定放20个管子。 移取预先在水浴中加热20min的缓冲底物溶液20ml于50ml锥形瓶中,并加入预先在水浴中加热20min 0.5%氯化钠溶液5ml,将锥形瓶置于水浴中。在零时间迅速移取5ml的样品制备液于已平衡的底物中,立即搅动混匀,然后塞紧锥形瓶,放回水浴中。10min后,从50ml锥形瓶中移取lml的反应混合液于一个盛有碘稀释溶液的试管中,摇动试管,把试管内容物注入到比色管中,在比色计上比色盘的背后用一含水试管,立即以参考比色标准为对照进行比色[注:确保移液管尖头没有接触碘溶液;碘带回到水解混合物中将影响测定结果。]。同样地,在准确的时间间隔内重复移取和比色步骤,直至达到α-淀粉酶的颜色,记录这时所耗的时间。在2次比色相隔30s时,若一次比参考比色标准深些,另一次比参考比色标准浅些,则在最接近的0.25min时记录为终点。13mm比色管在连续读数之间应摇动倒空。使用棱镜附件并且让比色计到操作人员眼睛间的距离保持8~13cm,可使操作人员之间对颜色辨别的轻微差异减至最少。 一个酸活化淀粉酶单位(AAU)定义为:在30℃、pH4.8时,以每小时1g的速度将可溶性淀粉糊精化所需淀粉酶的量。 (二) α-淀粉酶的活性检验
1.3,5-二硝基水杨酸法 (1)原理:用3,5-二硝基水杨酸测定α-淀粉酶在水解淀粉时所产生的糖量来表示其活力。活力单位:在25℃下,每分钟能催化分解底物后产生1btmol麦芽糖的酶量,称为1单位。 (2)测定方法 ①称取一定量样品,用水稀释至适当浓度,配成待测酶溶液。 ②在25℃恒温条件下,取试管4支,于第一支空白管(A)中加底物溶液0.5ml及重蒸馏水0.5ml。 ③于第二支试管中(B)加底物溶液0.5ml,迅即加入待测酶液(1)0.5ml,立即记时,于25℃下准确保温3min。 ④于第三支标准空白管(C)中加重蒸馏水lml。 ⑤于第四支标准管(D)中不加任何溶液。 ⑥然后立即在4支管中各加3,5-二硝基水杨酸显色剂各lml,于第四支标管(D)中加麦芽糖标准溶液lml。将4支管在100℃水浴中沸腾5min,放冷后各加重蒸馏水10ml。 ⑦以重蒸馏水为参比液,在波长540nm处分别测定A、B、C、D 4支管的吸光度值。 2.交联淀粉多聚物底物法 (1)原理:底物为带有一蓝色染料的水不溶性交联淀粉多聚物。它可被α-淀粉酶水解,产生水溶性的蓝色片段。蓝色溶液的吸光度是样品中。-淀粉酶活性的函数。 在所述条件下,1个α-淀粉酶单位在lmin内催化水解lμmol糖苷键。 (2)操作步骤 ①酶样:吸取200μl适宜的酶稀释液(于0.1mol/L醋酸钠缓冲液中,pH5)和4m1的试液,置试管中,于37℃平衡5min。用钳子加入酶试片,混合10s。精确地于37℃下培养15min。反应时间从试片加入时算起。加入0.5mol/L氢氧化钠溶液lml混匀。过滤,以试剂作空白在620nm处测定其吸光度。 ②试剂空白:于3712下平衡4.2ml试液5min。用钳子加入酶试片,混合10s。于37℃精确地培养15min。加入0.5mol/L氢氧化钠溶液lml,混匀,过滤。 吸光度与α-淀粉酶活性成比例,酶活性可从酶试剂盒读出。计算最终活性时应注意稀释因子。 (三)细菌性口-淀粉酶的活性检验
1.芽孢杆菌变种衍生物法 (1)原理:该分析方法用于测定从枯草芽孢杆菌变种(Bacillussubtilis var.)和地衣型芽孢杆菌变种(Bacillus licheniformis var.)衍生制备的酶制剂中以细菌性淀粉酶单位(BAU)来表示的α-淀粉酶活性。该方法不仅能够特定地测定出含有β-淀粉酶产品中的α-淀粉酶,而且能够测出在pH6.6时总的淀粉酶活性。该分析是以在pH6.6和温度30℃时使淀粉溶液的水解达到一标准程度所需要的时间为基础的。通过比较水解产物与标准物的碘颜色来测定水解的程度。 (2)操作步骤 ①取13mm×l00mm试管数支,逐一加入碘稀释液5ml,置于保持在30±0.112的水浴中,每次分析允许放置20支试管。 ②吸取淀粉底物溶液20ml,置于50ml的锥形烧瓶内,加塞,于30℃的水浴中平衡20min。 ③于零时间,迅速吸取样品制备液10ml加至平衡后的混合液中,立即搅拌使之混匀,将烧瓶密塞,并放回水浴中。10min后,从50ml的烧瓶中吸取反应混合液lml转移至含有碘稀释液的试管中,振摇,并将内容物倒人比色管中,立刻与比色计内的参照比色标准进行比较,以一试管水作为该比色盘的背景[注:确保吸管的尖部不接触碘溶液;将碘带回到水解混合液中将影响测定结果]。用同样的方法以精确的间隔时间,重复进行转移和比色的操作,直到达到。-淀粉酶的颜色为止,并记录间隔时间。如果间隔30s进行的2次比较结果为一次比参照比色标准深,另一次比参照比色标准浅,那么将最接近的0.25min记录为终点。每次读数后,应将13mm比色管中的内容物倒空。通过使用棱镜配件可以使不同操作者之间在颜色辨别方面存在的轻度差异减少到最低程度,比色计和操作者的眼睛间的距离应保持在15~25cm。 1个细菌性淀粉酶单位(BAU)定义:在指定的试验条件下,每分钟使lmg淀粉糊精化所需酶的量。 2.糖苷裂解产物反应法 (1)原理:α-淀粉酶能使经缓冲处理后的极限糊精α-(1,4)糖苷键断裂,产生麦芽糖和小分子糊精。裂解产物与碘溶液发生反应,将出现的颜色(当淀粉被分解时,颜色从蓝色变为红棕色)与标准色溶液进行对比。为了准确起见,糊精化作用的时间应该控制在10~20min。 (2)操作步骤:酶制备液按表中所列的规定,用酶稀释液对酶进行稀释。每次测定时均包括适当的对照。
样品稀释度及稀释方法
①将淀粉底物溶液10ml转移至1支适当的试管中,于40℃培养几分钟。 ②加5ml酶(已预热3min),开始计时并混合。 ③准备数支试管,逐支加入碘稀释液5ml,每个样品的分析需12~16支试管。 ④用去离子水将分光光度计调零,并测定颜色标准在620nm波长、lcm光程比色池中的光密度。 ⑤在第②步操作10min后,按一定的时间间隔,从淀粉一酶试管中吸取lml样品,加至5ml碘稀释液中,摇匀并在分光光度计上620nm波长处测光密度。 ⑥当反应液的颜色趋近颜色标准时,每隔lmin或0.5min吸样1次并与碘稀释液进行反应。当样品的光密度达到颜色标准的光密度时,即达到终点。 ⑦间隔30s进行的2次比较显示:1次比标准颜色深,另1次比标准颜色浅,那么将最接近的0.25min记录下来作为终点。如果不到10min即达到终点,应使用进一步稀释的酶,反之亦然。时间应该控制在10~20min之内。 (3)单位定义:一个细菌性。-淀粉酶单位系指在(40±0.1)℃和pH6.0的条件下,每小时分解5 830mg淀粉所需要酶的量。 (四)葡萄糖淀粉酶的活性检验
1.原理在下列条件下,葡萄糖淀粉酶可以水解标准可溶性淀粉,生成葡萄糖。 淀粉25g/L,温度60℃,醋酸钠缓冲液1.0mol/L,培养时间60min,pH4.3±0.1。 用lmol/L NaOH溶液把pH提高到10.5就可以终止反应,生成的葡萄糖可以通过特殊的酶法进行测定。 1个葡萄糖淀粉酶单位(GAU):是指在该实验条件下,从标准可溶性淀粉释放1g葡萄糖的酶量。 2.操作步骤 (1)酶样品的稀释:准确称量1份酶样品定量转入2 000ml容量瓶中,加入40ml、pH4.3的lmol/L醋酸钠缓冲溶液,用蒸馏水稀释至刻度并混匀。该溶液最后的活性大约为160~220GAU。 (2)淀粉的水解:分别移取100ml缓冲底物于2个250ml锥形瓶中,1个做酶样,另1个做空白。盖上瓶塞后在水浴中加热到(60±0.1)℃。 加入lml稀释的酶样液于1个锥形瓶中,混匀后在60℃下准确培养60min,一直要盖上瓶盖。同样地,空白瓶也要培养60min。 反应60min后,给每个锥形瓶中加入预定体积的lmol/LNaOH溶液使反应停止。确定所加NaOH的体积是为了使100ml缓冲底物的pH为8.5~10.5。在空白瓶中加入lml稀释酶样液。 (3)葡萄糖的测定:分别移取培养后的酶样品液和酶空白液各100μ1于2支试管中。移取100μl 5mmol/L的葡萄糖标准液作为标准管,移取100μl 蒸馏水作为试剂空白管。给上述试管中移入5ml“己糖激酶”试剂,然后在室温下反应10min。在340nm波长处,以蒸馏水调零,测定各管的吸光值。
负责人熊本海博士



copyright © 2016 动物科学与动物医学数据分中心
版权所有:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
维护制作:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所畜牧信息中心