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日期20020613名称饲料用蛋白酶的活性检验
副类别饲料用酶制剂的活性检验类别饲料质量检验
资料来源中国饲料数据库情报网中心
内容正文 饲料用蛋白酶的活性检验

(一)、中性蛋白酶的活性检验

  1.原理:将缓冲的酶溶液加至pH7的酪蛋白缓冲溶液中,将混合物在30℃下消化10min。过量的酪蛋白用三氯乙酸沉淀,并通过过滤除去。滤液中酪氨酸的量在660nm波长处用分光光度法测定。结果用“中性蛋白酶单位”(NPU)表示。1个NPU是指在特定条件下作用于酪蛋白底物每分钟产生lμg酪氨酸所需的酶量。
  2.操作步骤

  (1)移取5ml酪蛋白溶液,加入20ml试管中,并在30℃保温15min。对每个待测的酶都要用3支试管,其中2支作样品管,1支作酶空白。每次试验都应包括1个底物空白。
  (2)向2支样品管中各加lml酶溶液,向底物空白管加lml 0.002mol/L的乙酸钙缓冲溶液。彻底混匀并立即放回30℃水浴中,记录加样时间。
  (3)准确10min后立即向各管快速加入5ml三氯乙酸试剂(为安全起见,请用自动移液器)。对于酶空白管,加完lml酶溶液后即加TCA。
  (4)将各管剧烈混合并在30℃保持30min,以完全沉淀酪蛋白。
  (5)30min结束时,剧烈振摇各管并通过11cm的Whatman 42#滤纸过滤,将前半部分的滤液再次通过相同的滤纸过滤。
  (6)移取2ml滤液至1支试管中,加9ml 0.4mol/L的Na2CO3,然后加lml稀释的福林试剂。立即混匀并在30℃保温30min以显色。
  (7)用底物空白校正仪器的零点,读取660nm波长处的吸收值。通过减去相应的酶空白吸收值,求得待测酶的正确读数。从标准曲线图上求得产生的酪氨酸量。
  3.标准酪氨酸曲线的绘制

  (1)将100mg L-酪氨酸小心地溶于60ml 0.1mol/L HCl中制得酪氨酸溶液。酪氨酸必须完全干燥并且是色谱级别。一定要让酪氨酸完全溶解,并用去离子水稀释至1L。该溶液含酪氨酸100μg/ml。
  (2)根据下面的规定,从上述贮备液制备含酪氨酸10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml的稀释液。
  贮备酪氨酸容量(m1)1、2、4、6、8;
  去离子水容量(m1)9、8、6、4、2。
  (3)移取上述稀释液各2ml,加入一系列试管中。加9ml 0.4mol/L Na2CO3,然后加稀释的福林试剂lml至各试管。立即混匀并在30℃下培养30s以显色。测定660nm波长处的吸收值并将结果绘成图,应该得到一条直线。
  (二)蛋白酶的活性检验

  1.原理 分光光度法。
  2.操作步骤
  (1)定性。
  ①将底物倒人培养皿并让其固化。
  ②在琼脂上挖出小井,并用软化的底物糊住底部。
  ③向各小井加5~50μl的培养物上清液或酶液。
  ④37℃培养。
  ⑤15min后用饱和硫酸铵液浸渍平皿。
  ⑥沿井边的清晰圈即显示蛋白酶的活性。
  (2)定量
  ①向0.5ml的偶氮酪蛋白溶液(底物)中加0.5ml的酶液。
  ②37℃培养。
  ③20min后,加3.5ml猝灭剂(TCA)。
  ④1400 r/min离心15min。
  ⑤加4.5ml NaOH,在波长420nm处读取吸光值。
  ⑥标准:0~2.0μg/ml胰蛋白酶。
  ⑦未知蛋白酶的活性用胰蛋白酶的等效单位表示。
  (三)细菌蛋白酶的活性检验

  1.原理 分光光度法。
  2.操作步骤
  (1)向一系列25mm×l50mm试管中各移取10ml底物溶液,1管用作空白,其余用来检测酶样。用49塞盖紧,在37℃水浴中平衡约5min。
  (2)在零时间,向各管加2ml酶稀释液。向空白管加2ml稀释液。加完酶后立即混匀。
  (3)准确培养30min,然后加10.0ml三氯乙酸(TCA)试剂,摇匀并在37℃下放置30min。
  (4)再次摇动各管,并用11cm Whatman 42#滤纸过滤。
  (5)用lcm光程的比色池,与空白比较,在分光光度计或相当的分光光度计上读取波长275nm处的光密度值。
  (6)当分析低活性样品时,需要另加1个空白,以校正酶样中存在的可溶于TCA的物质。移取10ml底物溶液于1个25mm×l50mm的试管中,加10ml TCA试剂,然后加2ml稀释的酶制剂。过滤后测定该制备液的光密度,从测样试管的光密度值减去这个读数。当测定同种酶的不同量时,与最高浓度的酶一起做这样1个对照,并通过内推法来计算较低含量的校正值是可行的。
  (7)校正曲线。取100mg酪氨酸标准晶溶于60ml 0.1mol/L HCl中。一定要让酪氨酸完全溶解并用蒸馏水稀释至1L。该贮备液含酪氨酸100μg/ml。制备含酪氨酸25μg/ml、40μg/ml、75μg/ml的3个稀释液,并测定在波长275nm处的吸收值。将结果绘成曲线图。将得到一条通过原点的直线。取图上60μg/ml处的值,除以40就得到1.5μ/ml的吸收值。得到的结果是接近于0.011 4的一个数值。
  (8)单位定义。1个活性单位是指在测定条件下lmin内产生1个水解物所需的酶量,其水解物在波长275nm处的吸收值与每毫升中含1.5μg酪氨酸的盐酸溶液相同。
  (四)胃蛋白酶的活性检验

  1,原理 容量分析法。
  活性的定义: 胃蛋白酶的活性表示为胃蛋白酶的重量与它所能够分解的凝结卵清蛋白的量的倍数。食品化学法典(FCC)规定,胃蛋白酶消化凝结卵清蛋白的量应在其重量的3000~3500倍之间。
  2.操作步骤
  (1)取lmol/L盐酸溶液35ml,与385ml水混合。准确称取供检验的胃蛋白酶粉100mg,溶于150ml上述溶液中。准确称取胃蛋白酶标准品,同法制备相似的标准品溶液。
  (2)将1个或数个鸡蛋煮沸15min,作为供测定用的凝结蛋白。煮沸后立即浸于冷水中冷却至室温;剥皮、去膜和蛋黄,立刻将蛋白过一清洁、干燥的40号0.42mm孔径筛,弃去先过筛的蛋白。分别取随后过筛、混匀的蛋白10g,置于约100ml的3个广口瓶中。1次或分次加35ml稀酸,用适当方法使蛋白微粒充分分解。
  (3)将瓶子置于52℃水浴中。待瓶中内容物的温度达到水浴的温度后,1个瓶中加入5ml胃蛋白酶的酸溶液,第二个瓶中加入4.3ml胃蛋白酶的酸溶液和0.7ml稀酸溶液,第三个瓶中加入5ml胃蛋白酶标准溶液。立刻将瓶口密塞,倒置混合3次,于52℃下保持2.5h,每隔10min将瓶子倒置一次使内容物混合。
  (4)取出瓶子,将内容物倒人100ml圆锥形测定容器中,该容器底部直径不超过1cm,0~0.5ml以0.05ml为一小刻度;0.5~2ml以0.1ml为一刻度;2~3ml以0.2ml为一刻度;3~5ml以0.5ml为一刻度;5~10ml以lml为一刻度;10~25ml以5ml为一刻度;并有50ml、75ml和100ml的刻度标记。
  (5)用水将粘在瓶壁上未消化的蛋白分别转移至各自的测定容器中,每份的用水量不超过50ml。将每个测定容器的内容物混匀,放置30min。含有5ml待测胃蛋白酶溶液测定容器中未溶解蛋白的体积,不得大于内含5ml胃蛋白酶标准晶溶液测定容器中未溶解蛋白的体积;含有4.3ml待测胃蛋白酶溶液测定容器内未溶解蛋白的体积,不得少于内含5ml胃蛋白酶标准品溶液测定容器中未溶解蛋白的体积。
  (五)木瓜蛋白酶的活性检验

  1.原理 比色法。
  单位定义:1个木瓜蛋白酶活性单位相当于在检测条件下,以及在酶的浓度可使被检测溶液每毫升释放出40μg酪氨酸的条件下,使特定的酪蛋白底物释放1μg酪氨酸的酶活性。所用木瓜蛋白酶含有6 000木瓜蛋白酶单位/mg。
  2.操作步骤
  (1)样品的准备:精确称取一定量的样品使其活性相当于100mg参考标准。完全按照木瓜蛋白酶标准液的制备过程制备。
  (2)检测
  ①在12个带有玻璃塞的100ml的容量瓶中各加入25ml酪蛋白底物,一式2份标记容量瓶(除了空白对照,每个检验均做双份),S1、S2、S3代表木瓜蛋白酶标准液,U2为样品,剩下4个瓶标记为S1B、S2B、S3B和U2B表示空白对照。
  ②分别在S1、S2和S3瓶以及它们各自相对应的对照S1B、S2B、S3B中加入5ml,2.5ml、0ml的缓冲液,在U2和U2B中加2.5ml缓冲液。所有瓶子均放进40℃水浴锅中并保温10min。
  ③在S1、S2和S3瓶中分别移人5ml、7.5ml和20ml木瓜蛋白酶标准液,边加边旋动瓶子以混匀,加塞再放入水浴中,加液的同时开始计时。同样地往2个小瓶中加入7.5ml样品溶液。
  ④刚好60min时,往所有的12个瓶中均加入15ml 30%TCA溶液并用力摇动。4个空白对照管中,S1B、S2B、S3B分别移人5ml、7.5ml、10ml木瓜蛋白酶标准液,而U2B中加75ml样品液。所有的瓶子再放人40℃水浴锅中30~40min,让沉淀的蛋白充分凝集,用Whatman 42#滤纸或同类滤纸过滤,并将前半部分滤液用同一滤纸重新过滤一次(滤液必须完全澄清)。
  3.计算 依照各自的空白对照在280nm波长下读取滤液的吸光值,以S1、S2的读数值对相应的50ml待测混合液中酶浓度(mg/m1)作曲线,通过曲线内推法,考虑稀释因素,按照公式计算出样品的活性,表示为木瓜蛋白酶活性单位/mg。
  (六)胰蛋白酶制剂的活性检验

  1.原理 比色法。
  2.操作步骤
  (1)血红蛋白的制备
  ①将牛血离心20~30min,吸去红细胞上面的血清和白细胞层,然后加入与红细胞等量体积的1%NaCl溶液混匀,离心,弃去上清液。将红细胞冷冻保存或先将红细胞迅速透析后再冷冻保存。在用直径为19.05mm的杜邦玻璃纸管透析时,红细胞释放出大量不被三氯乙酸沉淀的产色物质。玻璃纸存放时容易变质,尤其是充分暴露于空气的卷筒外层。因此,有必要检查透析管是否漏。将管的一端用水浸湿后打结系紧,然后将管中灌满水,再将开口端拧紧并折叠过来,用一只手压紧折叠部位,另一只手挤压管壁。挤压不仅可以看出是否漏,而且可以使管伸展,这样可以避免透析过程中过分地伸展和稀释。如果管子合格,将管中的水倒掉,放进一块大理石,再加入洗过的红细胞,然后将管口用玻璃纸打结、封好。把管放到一个高的容器里,让冷自来水直接流进容器的底部,水流速度应能使管子产生充分的振荡。管子时常地倒转,其中的大理石使管中的血红蛋白溶液得以搅动。24h后,把所有透析管中的血红蛋白液混到一起,装入小铝盒或冰淇淋纸盒中冷冻保存,可以1次制备供几千份蛋白酶测定用的透析血红蛋白。
②为估测透析血红蛋白中蛋白质的浓度,称取样品3~5g,放人瓷蒸发皿中,105℃条件下干燥过夜,记录其干重。每立方厘米的样品所含蛋白量(g)为:

蛋白浓度(g/cm3)=蛋白干重/((样品重-蛋白干重)+0.73蛋白干重)

  ③如果冷冻存放透析过的血红蛋白不方便,可使之干燥成粉状,室温下保存。如果冷冻保存的血红蛋白溶液变干,其仍然可再溶解。
  ④当空白不重要时,可用洗过的干燥红细胞组成的血红蛋白做粗略的分析。
  ⑤酪蛋白和麻仁球蛋白或蛋清蛋白可替代血红蛋白,但明胶蛋白不能使用,因为三氯乙酸不能使其沉淀。
  (2)酚试剂 按照Folin和Cioclateau(1927)方法配制的酚试剂,再加2倍其体积的水即可。本文中所提及的酚试剂均指此稀释液。
  (3)血红蛋白底物
  ①取8ml 1mol/L NaOH、72ml水、36g脲和10ml 22%的血红蛋白(每l00ml溶液中含22g血红蛋白)混合成溶液。这种碱性溶液在25℃下放置30~60min以使血红蛋白变性。然后将它与由l0ml lmol/L KH2PO4和4g脲组成的溶液混合,最终pH为7.5,每50ml血红蛋白溶液加lmg硫柳汞防腐。将溶液存于5℃下,可保存数周。
  ②当然,只要将各种成分按照给定的方法和比例混合,便可以配制更少或更多量的底物溶液。
  ③用自动移液管加4ml 2.5%血红蛋白溶液于175mm×X20mm的试管中,再加入lml 0.3mol/L HCl,最终pH为1.6,将此酸性底物溶液存放于5℃下,并在1天或2天内使用,因为有些情况下空白试验的值会随着时间的延长而升高。如果底物溶液需放置1h以上才用,那么需将试管口塞住。
  (4)消化和显色
  ①在25℃条件下进行消化,用一带孔的木块或胶木做试管支架,孔径略大于试管直径,试管悬浮于水浴中。消化前要使酶和底物的温度达到消化温度。
  ②在5ml底物液中加入lml酶溶液,振荡混合,10min后加入l0ml 0.3mol/L三氯乙酸(滴定测得),用力摇动试管,30min后过滤此悬浮液。
  ③过滤时须用不吸附分解物的滤纸,如Whatman 3#无论三氯乙酸沉淀的蛋白是过滤去掉还是离心去掉,其分解物的色值应该相同。
  ④在50ml容量的锥形瓶中加5ml消化滤液,再加入10ml 0.5mol/L NaOH,然后边摇烧杯边加入3ml酚试剂。由于颜色的形成,在一定程度上依赖于酚试剂加入的速度。因此,规定酚试剂以滴状流出滴定管的最快速度为标准速度。2~10min后对照标准来判定颜色。
  (5)标准
  ①酪氨酸标准液含有0.000 8mmol/L的酪氨酸(0.011 2mg酪氨酸氮)、5ml 0.2mol/L HCl和0.5ml甲醛(防腐剂)。其浓度用凯氏定氮法测定。按照上述方法加入10ml 0.5mol/L NaOH溶液和3ml酚试剂以保持5min显色时间。
  ②实际操作中,用一蓝色玻璃代替含0.000 8mmol/L酪氨酸的蓝色溶液作为标准。为了不必找到一个与酪氨酸一酚试剂溶液颜色完全相同的蓝玻璃,可在比色计目镜的内或外放1个241号Corning蓝色玻璃滤片,各种蓝色经此滤片后都变成完全一致的单色红光。蓝色玻璃标准要用酪氨酸标准液校正,要经常复查。
  (6)空白 将10ml 0.3mol/L的三氯乙酸与5ml血红蛋白溶液混合,加lml酶溶液,摇动试管;加悬浮液再摇,30min后将悬液过滤。当用纯化酶溶液进行消化时,酶不会使空白值升高,将10ml 0.3mol/L三氯乙酸加入到5ml血红蛋白和lml水的混合液中。将lml酪氨酸溶液(含0.000 8mmol/L的酪氨酸溶于含0.5%甲醛的0.1 mol/L HCl中)加到5ml空白三氯乙酸滤液中,待加入10ml NaOH和3ml酚试剂后,产生颜色,5min后参照标准进行判定。
  (七)凝乳酶活性的检验

  1.原理 凝乳酶活性,是通过凝乳酶溶液和标准强度的凝乳酶提取液之间,对牛奶凝结能力的比较来测定的。
  单位的定义:一种标准的凝乳酶提取液被公定为100RU/ml(RU:凝乳酶单位)。这种标准每月更换1次,并且要与前1个月的标准进行检查比较。
  2.操作步骤 
  (1)试验在30℃下进行,在125ml的广口瓶中加25ml底物,再加lml稀释酶,在Hill所说的仪器上以16r/min的速度旋转,用Sommer和Matsen所提及的改良方法来测定凝乳时间,当转动的玻璃表面刚一出现清晰可见的微粒时,就作为终点。
  (2)不同批次的底物与凝乳酶作用,其凝乳时间不同,因此标准液的测定必须用同一底物同时进行。
  (3)对未知凝乳酶溶液要用蒸馏水稀释并调节其浓度,使其能与1:250的标准稀释液在10r/min之内产生凝固。
  (4)氮的测定。凝乳酶块中氮的含量用微量KJeldahl法(AOAC方法,11版,1970)测定。
  (5)凝乳酶的纯化和结晶作用
  ①在室温下用3mol/L HCl将粗制凝乳酶浸出液的pH调到5。然后加入NaCl使之饱和,溶液用带有854号角帽的国际冷冻离心机以5000r/min(最大)离心45min,产生沉淀(沉淀物工)。
  ②将沉淀物I用蒸馏水溶解使体积达到原体积的1.5倍,用0.1mol/L NaOH调pH至6.3,然后过滤。
  ③重复步骤①和②,直至产生4种盐沉淀物(沉淀物I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),将已溶解的沉淀物Ⅳ稀释成和沉淀物Ⅲ溶液体积相同的溶液。
  ④将钾明矾(每l00ml凝乳酶溶液加1g)用少量的水溶解,加到沉淀物Ⅳ溶液中,立即用0.1mol/L NaOH中和使pH至6.3。所产生的氢氧化铝凝胶通过5 000r/min(最大)离心15min去除。保留明矾上清液。
  ⑤用0.1mol/L HCl调钾明矾上清液的pH至4.6并加NaCl使之饱和,上清液中的凝乳酶被沉淀下来,用离心机以5 000r/min(最大)离心45min,将其分离出来(沉淀物V),弃去上清液。
  ⑥将沉淀物V用最小量的pH6.8的0.05mol/L磷酸钠缓冲液溶解,并在2℃下用含盐Berridge氏缓冲液(每升含50g MgCl2·6H2O和15g CH3COONa·3H2O,用5mol/LH2SO4调pH至5.4)透析。
  ⑦几天后形成结晶并持续大约4周,加少量上一批的结晶做为种子结晶,可以加速结晶的形成。
  ⑧结晶用结晶化缓冲液洗2次,用含0.3%NaCl、pH为5.6的0.05mol/L醋酸盐缓冲液洗2次。
负责人熊本海博士



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