用户名: 密 码:
数据库:饲料质量检验另存文本打印浏览 【字体放大】 【字体还原】

日期20020613名称饲料用脂肪酶的活性检验
副类别饲料用酶制剂的活性检验类别饲料质量检验
资料来源中国饲料数据库情报网中心
内容正文 饲料用脂肪酶的活性检验

  (一)4-氨磺酰氯化重氮苯显色

  1.原理 在加脂酶制备液中,加4-氨磺酰氯化重氮苯显色,在460nm波长下测光密度。
  2.操作步骤
  (1)分析 
  ①按下述方法于临使用前制备缓冲底物溶液,所有试剂应置于室温。取0.067mol/L磷酸盐或枸橼酸盐缓冲液40ml和水约50ml,置于100ml容量瓶中,轻轻摇动混合,用吸管慢慢加入酯贮备液lml,吸管的尖部应低于混合液的表面,加水稀释至100ml。
  ②吸取缓冲底物溶液5ml,转移至已校准为25ml 25mm×200mmPyrex试管中。将试管置于恒温水浴锅中。经温度均衡后,加酯酶制备液lml,充分混合。下一步即是培养,培养所需要的时间要预先通过底物的水解速率来确定,加入1.0mol/L、pH6.8的磷酸盐缓冲液5ml进行培养。然后,立刻加入4-氨磺酰氯化重氮苯溶液0.5ml。等待准确lmin使颜色出现,加1.6mol/L盐酸液5ml。将试管置于沸水中,滚沸20min。冷却至室温。加3.3mol/L氢氧化钠液5ml,使其沿试管壁加入。不应过分摇动,加水稀释至25ml,充分混匀。在460nm波长处测定光密度,使用对照液作为参比空白,该对照液经预先加热培养使其中的酯酶无活性。
  ③多个酯酶制备液可以同时进行分析,方法为间隔2min,交错地将酶加入到缓冲底物溶液。为了保证所有的样品能够培养相同的时间,向每个试管中相继加入lmol/L磷酸盐缓冲液、4-氨磺酰氯化重氮苯溶液和1.6mol/L盐酸液,总共需要时间约为1.5min,也应间隔2min交错地进行。在加入盐酸液之后这一阶段,其操作步骤不需要立刻进行,因为不将混合液暴露于日光之下,颜色是稳定的。
  (2)标准曲线:采用与制备缓冲底物溶液相同的方法,用2-萘酚的1,4-二唿烷贮备液和Briii35制备该化合物的缓冲溶液。取这些缓冲溶液各5ml,除用酯酶培养外,还要按分析技术进行同样的操作。当测定最终溶液的光密度时,使用不含2-萘酚的对照液作为参比空白。2-萘酚的贮备液即使在冰箱中保存,也不如2-萘基酯贮备液稳定。因此,应于使用前新配。标准曲线可重复使用,这样可以避免每次分析时制备标准的麻烦。
  (二)脂肪酸生成法

  1.原理 酯酶在一定条件下能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油。所释出的脂肪酸可用碱液滴定,以此确定其活力。
  活力单位:在37℃下,每分钟能催化产生lμmol脂肪酸的酶量,称为1单位。
  2.分析步骤
  (1)称取一定量样品,用水稀释至适当浓度,配成待测酶溶液。
  (2)取三角烧瓶2只,在37℃恒温下测定。于第一只空白瓶(A)和第二只试样瓶(B)中各加0.025mol/L pH4.5磷酸缓冲液5ml、底物溶液4ml和20%牛磺胆酸钠水溶液0.4ml。
  (3)于A瓶中加入95%乙醇15ml后,再于2瓶中迅速各加待测酶液0.1ml,立即混匀并记时,在37℃下保温10min。于B瓶中立即加95%乙醇15ml后,各加酚酞试液0.1ml,然后用0.05mol/L氢氧化钠滴定至微粉红色,其耗用量分别为A1和B1
负责人熊本海博士



copyright © 2016 动物科学与动物医学数据分中心
版权所有:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
维护制作:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所畜牧信息中心