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日期20020613名称饲料用纤维素酶制剂的活性检验
副类别饲料用酶制剂的活性检验类别饲料质量检验
资料来源中国饲料数据库情报网中心
内容正文 饲料用纤维素酶制剂的活性检验

  (一)纤维素酶的活性检验

  1.原理 该分析方法能够对2种或更多种酶制剂的“纤维素酶活性”进行精确地比较。纤维素酶活性被定义为在分析条件下,能够使羧甲基纤维素发生降解酶的活性。当用纤维素酶培养时,羧甲基纤维素溶液的黏度迅速降低。在进行控制的实验条件下(温度、pH等),任何酶达到某一黏度降低值所需要的时间与酶的效力成反比。
  在分析条件下,该黏度降低速率近似为对数函数关系。这种近似对于黏度降低曲线上的限定部分(即通常称为允许范围)是比较理想的。
  该分析方法使用一种纤维素酶标准品来制备标准曲线。经过几次加热培养后来测定黏度降低的程度。将允许范围内的数值标注到半对数坐标纸上,得到一直线。当在同一条件下用新鲜底物加热培养某一活性未知的酶时,“相对纤维素酶活性”可以通过任一培养阶段之后测出的黏度降低值来计算(黏度降低在允许范围的条件下)。相对纤维素酶活性被定义为Ts/Tu,Ts为标准品的加热培养时间,Tu为未知酶的加热培养时间,此时标准品所产生的黏度降低与未知酶所产生的黏度降低相同。
  2.操作步骤 羧甲基纤维素的酶促黏度降低对温度极为敏感。因为活性的报告是与在同一条件下分析的标准酶进行比较得来的,那么如果能够遵守下、述注意事项,该分析就可于室温下进行。底物和稀释剂在使用前必须平衡至室温;如果在一系列测定过程中,周围温度变化每超过1℃,那么必须制备这一温度下的新标准曲线。
  (1)酶标准曲线:加底物(准确8m1)至一具螺旋盖的试管中(15m1),当准备就绪后,加稀释的酶标准液(准确0.5m1),并启动记秒表。立即将螺旋盖拧紧,经多次倒转混合。仅握住螺旋盖部分,使来自手部的热传导降至最小。将反应混合液放至工作台上进行培养。
  准确记录净培养时间。在尽量短的时间间隔内,将收集的反应混合液倒回至注射器内,再重复该操作2次。这3次测定的净培养时间应该包括从60~400s左右的时间值。如果酶的稀释合适,所有3次流出时间均应在允许范围内。将这些数值标注到半对数纸上,即可得出可用来计算未知活性的标准曲线。3个点必须接近于一条直线。
  (2)未知物的分析:将未知活性的酶进行适当稀释,并按照酶标准物的方法进行分析。流出时间在有效范围内对于计算活性是必需的。
  (3)黏度计清洗:如果是按上述组装的黏度计,样品之间不需清洗。即当标准酶反应混合液开始流人时,将最初的几滴洗提液弃去。
  于贮存前,用水彻底冲洗,防止堵塞并保持塑料的非湿润特性。
  (二)滤纸纤维素酶的活性检验

  1.原理 1个滤纸活性单位(FPU)是指在特定条件下,在lmin之内能释放出lμmol的还原糖(用葡萄糖当量数来表示)。
  2.操作步骤
  (1)酶样品:放一片50mg的滤纸于试管底部,加pH4.8的0.05mol/L醋酸钠液lml,置于50℃水浴中平衡(滤纸必须充分浸湿)。加适宜的酶稀释液(用0.05mol/L醋酸钠缓冲液、pH4.8稀释)lml。加入酶之后及在加热过程中均不应混合。在50℃准确加热培养60min。加二硝基水杨酸(DNS)溶液3ml混合。煮沸该反应混合液5min,于冷水浴中进行冷却。
  (2)酶空白:取滤纸50mg,加pH4.8醋酸盐缓冲液lml,于50℃下加热培养60min。加DNS溶液3ml和酶稀释液lml。混合并煮沸5min,于冷水浴中进行冷却。
  (3)试剂空白:取滤纸50mg,加pH4.8醋酸盐缓冲液2ml,于50℃加热培养60min。加DNS溶液3ml,煮沸5min,于冷水浴中冷却。
  (4)测定:以试剂空白为对照,在540nm波长处测定酶样品和酶空白的吸光值。应将酶样品适当稀释,使其吸光值在0.3~0.5之间。
  (5)标准曲线:取无水葡萄糖1g,加去离子水溶解并稀释至100ml,制备成贮备葡萄糖溶液。将该贮备液稀释,分别制备成每毫升含0.2mg、0.4mg、0.5mg、0.8mg及lmg的5个以上稀释液。分别吸取每一稀释液lml,代替前述分析步骤中的稀释酶,用DNS处理后,以试剂空白为对照在540nm波长处测定吸光值。绘制吸光值对葡萄糖量(mg)的曲线图。
  (三)半纤维素酶的活性检验

  1.原理 该法用于由黑曲霉(Aspergillusniger var.)产生的半纤维素酶产品的活性测定。该测定方法的基础是在pH4.5、40℃下,特定的刺槐豆胶(locust bean gum)底物内部的糖苷键发生酶解,然后通过校准的黏度计测定相应的底物黏度的降低。
  2.操作步骤 将经过校正清洗的黏度计放人玻璃水浴锅中,并在精确的垂直位置上。移取20ml底物溶液和4ml醋酸钠缓冲液于50ml锥形瓶中,每个酶样品至少用2个锥形瓶和1个底物空白瓶。盖好瓶子并在水浴中平衡15min。移取lml样品液于平衡好的底物,并用计时器开始计时,混合均匀,立即移取10ml此混合液放人黏度计的宽臂侧。大约2min后,用接在黏度计窄臂侧的橡皮管把刻度线以上的反应混合液吸到液体腔里。让反应混合液自由地流经刻度上线并记录流出时间。当液面流到刻度上线时起动2号计时器,同时记录1号计时器的反应时间(TR)的分钟数。当反应混合物液面流到刻度下线时记录2号计时器的时间(TT)的秒数。立刻再将高于上线的反应混合液吸回推转液体腔。当液面自由流下到达刻度上线时,再起动2号计时器,同时记录1号计时器上的反应时间(TR)的分钟数。当液面流过刻度下线时,记录2号计时器的时间(TT)的秒数。再重复上述操作,直到总共4次测定的反应时间(TR)不超过15min。
  移取lml水到20ml底物溶液和4ml醋酸钠缓冲液中配成底物空白液,且立即移取10ml此混合液于黏度计的宽臂侧。测定液面在两刻度线间下落的时间(Ts)的秒数。测定5次,取平均值作为Ts。
  移取10ml作为水空白液且在(40±0.1)℃下使之平衡,加到黏度计的宽臂侧。测定液面在两刻度之间下落时间(Tw)的秒数。测定5次,取平均值作为Tw。
1个半纤维素酶单位(HCU)是指在特定条件下,在刺槐豆胶底物中5min内使相对流动性变化1的活性。

负责人熊本海博士



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