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日期20020613名称其他饲料用酶类的活性检验
副类别饲料用酶制剂的活性检验类别饲料质量检验
资料来源中国饲料数据库情报网中心
内容正文 其他饲料用酶类的活性检验

  (一) β-半乳糖苷酶(乳糖酶)的活性检验

  1.原理 在37℃、pH4.3时,每分钟能生成8~10μmol的邻硝基苯酚所需酶的量,定为1个乳糖酶单位(LU)。
  2.操作步骤
  (1)按顺序移取2ml稀释缓冲液和含1~3乳糖单位酶溶液试剂于15mm×l50mm试管中,加水至终体积为6ml。
  (2)在37℃下保温5min。
  (3)与底物开始反应,移取4ml底物于上述测试液中(该底物加入前应在37℃下预热5min)。
  (4)此反应混合液于37℃下培养20min。
  (5)准确培养20min后,准时加入lml Na2CO3-EDTA碱性试液以终止反应,并使溶液显色。
  (6)移取2ml稀释缓冲液和4ml水至1支15mmXl50mm试管中,在37℃下保温5min。在零时间加入恒温后的底物4ml。经37℃反应20min后加入lml碱性Na2CO3- EDTA试液,用比色计测定。
  (7)依次将2ml稀释缓冲液和酶液加到15mm×l50mm试管中,再加水至10ml。在37℃下保温20min后加lml碱性Na2CO3-EDTA溶液并同上进行比色测定。除非被测酶溶液有较深的颜色,否则不需要作酶空白实验。
  (二) β-葡聚糖酶活性的检验

1. 地衣聚糖底物法
  (1)原理:该方法用于测定从黑曲霉和枯草杆菌产生而制得的β-葡聚糖酶的活性。该法的原理是在40℃、pH为6.5时,使地衣聚糖底物水解15min,然后通过新亚铜试剂法测定因释放还原基团而产生的还原力的增加。
  (2)操作步骤:准备5支在25ml处有刻度的试管。在第一至第四支试管中移人2ml地衣聚糖底物。然后在40℃水浴中加热10~15min以达到平衡。平衡以后,第一支试管中加入lml磷酸盐缓冲液,第二支试管中加入lml标准葡萄糖溶液(标准葡萄糖),第三支试管中加入4ml新亚铜试液A和lml待测样品,第四支试管中加入lml待测样品,第五支试管中加入3ml磷酸盐缓冲液作为缓冲液的空白对照。
  将5支试管在40℃下准确加热15min后,在1、2、4、5支试管中分别加入4ml新亚铜试液A,同时在5支试管中分别加入4ml新亚铜试液B,然后用磨口玻璃塞将5支试管盖好(不能用橡皮塞),在较强沸腾水浴中准确加热12min使之发色,然后立即用冷水将其冷却至室温,并用水把每支试管内的溶液调到25m1。用蜡胶(parafilm)膜或其他适当密封材料将管口封严,倒转数次使之混匀。以第五支试管作为缓冲液的空白对照,用lcm的比色池,在450nm波长处测定每支管中溶液的吸光值。
  在本实验条件下每分钟释放1μtmol还原糖(以葡萄糖当量表示)所需酶的量被定义为1个β-葡聚糖酶单位(BGU)。
  2.还原糖法
  (1)原理:在测定的条件下,β-葡聚糖被β-葡聚糖酶水解,水解中生成还原糖。1个酶活性单位(BGU/m1)定义为:在实验条件下,每分钟释放出1μmol还原糖(以葡萄糖表示)所需的酶量。
  (2)操作步骤
  ①标准曲线:用无水葡萄糖(在105℃下干燥2h后再称重)作标准曲线。
  葡萄糖贮备液:将1g葡萄糖溶于100ml去离子水中而制得。
  葡萄糖稀释液:分别取2ml、4ml、6ml、8ml、10ml葡萄糖贮备液,加去离子水至100ml。然后每种稀释液各移取lml分别于一个试管中,再加入lml去离子水和3ml DNS试液(标准样),至少用2支试管作空白,分别加2ml去离子水和3ml DNS试液(试剂空白)。小心摇动空白管并与标准样管同时放人沸水浴中,准确加热5min,此段时间内水要保持沸腾。立刻将反应管放人冰水浴以终止颜色生成反应,然后再平衡至室温,摇动试管后,以水作对照,在540nm波长处测定各试管溶液的吸光值。
  ②测定
  样品溶液:移取至少lml或称重至少1g样品,用pH5的0.1mol/L醋酸钠缓冲液稀释而制得酶样品溶液。
  在进一步稀释或测定之前,应将0.1~0.5g酶粉末在100ml 0.1mol/L醋酸钠缓冲液中稀释,在室温下静置1h。
  酶溶液最后的活性应约在0.12~0.22 BGU/ml为好。
  酶样品:移取lml酶稀释液于试管中,30℃下保温至少5min,加入lml已平衡的β-葡聚糖底物使之开始水解,30℃下保温并搅拌准确至10min后,加入3ml DNS试剂,搅拌。使反应物准确地沸腾5min后,立即放人冰水浴中冷却反应物以终止显色反应,再平衡至室温。
  酶空白试验:30℃下将lmlβ-葡聚糖底物准确保温10min,加入3ml DNS试剂和lml酶稀释液后,搅拌且在沸水中准确地加热5min。然后放人冰水浴中冷却以终止显色反应,再平衡至室温。
  以水为对照,在540nm波长下测定酶样品和酶空白的吸光值。
  (三)木聚糖酶的活性检验

  1.还原糖生成法
  (1)原理:1个木聚糖酶活性单位是指在确定条件下lmin内能催化产生lμmol还原糖(折算成木糖)。
  (2)操作步骤
  ①酶样品:取lml适当稀释的酶溶液(0.05mol/L醋酸钠缓冲液),置50℃恒温水浴中平衡。加lml木聚糖底物,混匀,在50℃下准确培养30min。加3ml DNS溶液,混匀,煮沸此反应物准确5min,于冷水浴中冷却。
  ②酶空白:取lml木聚糖底物,置50℃恒温水浴中准确培养30min,加3ml二硝基水杨酸(DNS)溶液和lml酶溶液,混匀,并煮5min,冷水浴中冷却。
  ③试剂空白:取lml醋酸盐缓冲液(pH5.3)在50℃恒温水浴中平衡,加lml木聚糖底物,混匀并在50℃恒温水浴中准确培养30min,加3ml DNS溶液,煮沸5min,冷水浴中冷却。
  ④测定酶样品及空白:测定在波长540nm处的光吸收值(以试剂空白管调零);酶样品的稀释度应控制在使其吸收值为0.3~0.5。
  ⑤标准曲线:以醋酸缓冲液作稀释液,用禾水木糖制备标准溶液(木糖浓度在0.05~0.5mg/ml之间)。用lml标准溶液代替上述方法中的酶溶液,并作与酶样品同样的处理。描出吸收值对木糖量的曲线。
  根据标准曲线计算稀释的酶所释放木糖的量,从而确定酶的活性。在稀释时,酶的浓缩样应称重。其活性以每克样品表示。酶样品的稀释浓度应选择在使其吸收值为0.3~0.5。
  2.硝基水杨酸显色法
  (1)原理:本法的依据是在木聚糖溶液中生成还原糖,还原糖再与3,5-二硝基水杨酸发生反应,产生的颜色变化与释放的还原糖(以木糖表示)的量成比例,而此还原糖的量又与样品中木聚糖酶的活性成比例。读出540nm波长处的光密度值,并利用标准曲线将之转换成产生的木聚糖的微摩尔数,简称DNS法。
  1单位木聚糖酶活性是指在本法中指定的条件下,40℃、pH4.5时每分钟催化产生1μmol还原糖(木糖)的酶量。
  (2)操作步骤
  ①向每系列试管,分别一式3份加入lml木聚糖底物,40℃下培养2~3min。
  ②按一定的时间间隔,向每试管中加入lml酶溶液,并使之准确反应10min。
  ③以相同的时间间隔,向每试管中加入2ml DNS溶液使反应终止,加塞,将所有试管置沸水浴中准确5min。
  ④用lml去离子水代替酶的溶液,作为空白试剂管。
  ⑤制备酶空白管。向试管中加入lml木聚糖底物(每个样品1支试管),40℃下培养10min,加入2ml DNS后,再加入lml酶溶液。加塞,置沸水浴中准确5min。酶空白管应与样品管同时制备。
  ⑥所有试管置冰水浴中冷却,并加入10ml去离子水,充分混匀。
  ⑦用空白试剂对照对分光光度计进行调零,读出所有样品在540nm波长处的光密度值。样品的OD值减去酶空白的OD值,其范围应约在0.150~0.300之间。
  (3)注意事项

  ①每次测定中都应包括1个适宜的对照样。
  ②对照用的酶,应搅拌5~10min,直至完全溶解。
  ③如果分析人员不熟悉本方法所使用的试剂,则在使用前应仔细阅读每种试剂的试剂安全手册(MSDS)。
  (4)样品溶液的制备
  ①粉末样品:用精密天平准确称取样品,溶于去离子水中,以磁力搅拌器搅拌10min以上。
  ②液体样品:用精密天平准确称取所需体积的液体。用于制备具有不同强度的木聚糖酶活性的样品稀释液时作为参考。
  (四)葡萄糖氧化酶的检验

  1.原理 氧气挥发后压力下降。葡萄糖氧化酶用sarett单位来确定。1个sarett葡萄糖氧化酶单位是指下述实验条件和底物时,在过量的过氧化氢酶存在下,每分钟产生10mm<>sup3氧气的酶量。
  2.操作步骤 计算出磷酸氢二钠和DHAS用量后,溶于大约总体积的3/4水中,用浓磷酸调pH到5.9。再加1水葡萄糖溶解后,最后加水到所需体积。该底物可以无限期保存,且不必冷冻,但应避光和防止挥发。
  3.测定 将适量的酶试样(≤0.5g或m1)放人1个100ml容量瓶的瓶底。迅速加入25℃左右的底物至刻度并混匀。将一部分稀释的酶样加入1个或几个瓦勃氏烧瓶里,并将接好气压计的烧瓶放在30℃水浴中保温10min。以4cm振幅每分钟振动120次,此时将气压计反应瓶一边的活栓打开。温度平衡以后,塞上活栓,继续准确振动30min。调整气压计到反应瓶初始体积后,读出反应瓶内压力的变化。

负责人熊本海博士



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