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日期20020613名称天然有毒有害物质的检验
副类别饲料中有毒有害物质的检验类别饲料质量检验
资料来源中国饲料数据库情报网中心
内容正文 天然有毒有害物质的检验

  (一)饲料中异硫氰酸酯含量的测定

  1.气相色谱法

  (1)原理:配合饲料中存在的硫葡萄糖苷,在芥子酶作用下生成相应的异硫氰酸酯,用二氯申烷提取后,再用气相色谱测定。
  (2)测定
  ①试样的酶解:称取约2.2g试样于具塞的锥形瓶中,精确到0.001g,加入5ml缓冲液、30mg酶制剂、10ml丁基异硫氰酸酯内标溶液,用振荡器振荡2h,将具塞锥形瓶中内容物转入离心试管中,离心机离心,用滴管吸取少量离心试管下层有机相溶液,通过铺有少量无水硫酸钠层和脱脂棉的漏斗过滤,得澄清滤液备用。
  ②色谱条件
  色谱柱:玻璃,内径3mm,长2m;
  固定液:20%FFAP(或其他效果相同的固定液);
  载体:Chromosorb W,HP,0.18~0.15mm孔筛(或其他效果相同的载体);
  柱温:100℃;
  进样品及检测器温度:150℃;
  载气:氮气;
  流速:65ml/min。
  ③测定:用微量注射器吸取1~2μ1上述澄清滤液,注入色谱仪,测量各异硫氰酸酯峰面积。
  2.银量法
  (1)原理:菜籽饼粕中存在的硫葡萄糖苷,在芥子酶作用下可生成相应的异硫氰酸酯。用水蒸气后,再用硝酸银一氢氧化铵溶液吸收,生成相应的衍生硫脲。过量的硝酸银在酸性条件下,以硫酸铁铵为指示剂用硫氰酸铵回滴,再计算出异硫氰酸酯的含量。
  (2)测定
  ①样品处理:称取试样2.2g于事先烘烤并精确称重至0.001g的烧杯中,在103±2℃温度下烘烤至少8h,在干燥器中冷却至室温后,精确称重0.001g。
  ②试样的酶解:将上述烘烤过的试样全部转移至500ml三角烧瓶a中,加入100ml pH4缓冲液(将42g柠檬酸溶于1L水中,用浓氢氧化钠液调至pH4),同时加入0.5g粗酶制剂[取白芥(sinapisalba L.)种子粉碎后用冷石油醚脱脂,过0.28mm孔筛,置4℃冰箱中备用]。另取1个500ml三角烧瓶加入100ml pH4缓冲液和0.5g粗酶制剂,将三角烧瓶塞好塞子,置40℃恒温箱中保温3h,中间不时轻摇几次。
  ③蒸馏:将盛试样的三角烧瓶a冷至室温,加入几粒玻璃珠和几滴去泡剂(正锌醇),然后蒸馏装置相连,从上面漏斗中加入10ml 95%乙醇,另加3ml乙醇于接收瓶上的安全管中。缓慢加热蒸馏,至馏出液达到接收瓶b 70ml刻度处。
  (3)步骤:取下接收瓶b,将安全管中的乙醇倒人此瓶中,将它与回流冷凝器连接,于沸水中加热瓶中内容物30min,然后取下冷却至室温。将内容物定量地转移至100ml溶量瓶中,用水洗接收瓶b 2~3次,用水稀释至刻度,摇匀后过滤于100ml三角烧瓶中,用移液管取25m1滤液于另一100ml三角烧瓶中,加lml 6mol/L硝酸和0.5ml硫酸铁铵指示剂{取100g[NH4Fe(SO4)2·12H2O]溶于500ml水中},用0.01mol/L硫氰酸铵标准工作液()滴定过量的硝酸银,直到稳定的淡红色为终点。
  按同样测定步骤操作,但不加试样,得到空白测定值(参见中华人民共和国国家标准GB/T 13087-1991)。
  (二)饲料中嗯唑烷硫酮含量的测定

  1.原理 饲料中的硫葡萄糖苷被硫葡萄糖苷酶C芥子酶)水解,再用乙醚萃取生成的曙唑烷硫酮,用紫外分光光度计测定。
  2.测定
  (1)称取试样:菜籽饼粕1.1s,配合饲料5.5g于事先干燥称重(精确到0.001g)的烧杯中,放人恒温干燥箱,在(103±2)℃下烘烤至少8h,取出置干燥器中冷至室温,再称重,精确到0.001g。
  (2)试样的酶解:将干燥称重的试样全倒入1个250ml三角烧瓶中,加入70ml沸腾缓冲液,并用少许冲洗烧杯,使冷却至30℃,然后加入0.5g酶源和几滴去泡剂,于室温下振荡2h。立即将内容物定量转移至100ml容量瓶中,用水洗涤三角烧瓶并稀释至刻度。过滤至100ml三角烧瓶中,滤液备用。
  (3)试样测定:取上述滤液(菜籽饼lml,配合饲料2m1)至5ml分液漏斗中,每次用10ml乙醚提取2次,每次小心从上面取出上层乙醚。合并乙醚层于25m1容量瓶中,用乙醚定容刻度。从波长200~280nm处测定其吸光度值,用最大吸光度值减去280nm处的吸光度值,得试样测定吸光度值AE。
  (4)试样空白测定(菜籽饼此项免去):按同样操作,只加试样不加酶源,测得值为酶源空白吸光度值(参见中华人民共和国国家标准GB/T13089-1991)。
  (三)饲料中游离棉酚含量的测定

  1.原理 在3-氨基-1-丙醇存在下,用异丙醇与正己烷的混合溶剂提取游离棉酚,用苯胺使棉酚转化为苯胺棉酚,在最大吸收波长440nm处进行比色测定。
  2.测定步骤
  (1)称取1~2g试样<精确到0.001g),置于250ml具塞三角烧瓶中,加入20粒玻璃珠,用移液管准确加入50ml溶剂A,塞紧瓶塞,放人振荡器内振荡1h(每分钟120次左右)。用干燥的定量滤纸过滤,过滤时在漏斗上加盖一玻璃片,以减少溶剂挥发,弃去最初几滴滤液,收集滤液于l00ml具塞三角烧瓶中。
  (2)用吸量管吸取等最双份滤液5~lml(每份约含50~100μg的棉酚)分别至2个25ml棕色容量瓶a和瓶b中。
  (3)用异丙醇+正己烷混合溶剂稀释瓶a至刻度,摇匀,该溶液用作试样测定液的参比溶液。
  (4)用移液管吸取2份10ml的溶剂A分别至2个25ml棕色容量瓶a和瓶b中。
  (5)用异丙醇十正己烷混合溶剂补充瓶肋至刻度,摇匀,该溶液用作空白测定液的参比溶液。
  (6)加2ml苯胺于容量瓶b和bo中,在沸水浴上加热30min显色。
  (7)冷却至室温,用异丙醇十正己烷混合溶剂定容,摇匀并静置1h。
  (8)在波长440nm处,用分光光度计以瓶ao为参比溶液测定空白测定液瓶bo的吸光度,以瓶a为参比溶液测定试样测定液瓶b的吸光度,从试样测定液的吸光度值中减去空白浊定液的吸光度值,得到校正吸光度(参见中华人民共和国国家标准GB/T 13086-1991)。
  (四)饲料中氰化物含量的测定

  1.原理 以氰苷形式存在于植物体内的氰北物(hydrocyanic acid)经水浸泡水解后,进行水蒸气蒸镏,蒸出的氢氰酸被碱液吸收。在碱性条件下,以碘化钾为指示剂,用硝酸银标准溶液滴定定量。
  2.测定
  (1)0.1mol/L硝酸银标准贮备液
  制备:称取17.5g硝酸银,溶于1000ml水中,混匀,置暗处,密闭保存于玻塞棕色瓶中。
  标定:称取经500~600℃灼烧至恒重的基准氯化钠15g,准确至0.000 2g。用水溶解,移人250m1容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀。准确将此溶液移人25ml锥形瓶中,加入25ml水及lml 5%铬酸钾溶液,再用0.1mol/L硝酸银标准贮备液滴定至溶液呈微红色为终点。
  (2)0.0lmol/L硝酸银标准工作液:于临用前将0.1mol/L硝酸银标准贮备液煮沸,冷却后用水稀释10倍,必要时应重新标定。
  (3)试样水解:称取10~20g试样于凯氏烧瓶中,精确到0.001g,加水约200ml,塞严瓶口,在室温下放置2~4h,使其水解。
  (4)试样蒸镏:将盛有水解试样的凯氏烧瓶迅速连接于蒸馏装置,使冷凝管下端浸入盛有20ml 5%氢氧化钠溶液的锥形瓶的液面下,蒸镏,收集蒸镏液150~160ml,取下锥形瓶,加入10ml 0.5%硝酸铅溶液,混匀,静置15min,经滤纸过滤于250ml容量瓶中,用水洗涤沉淀物和锥形瓶3次,每次10ml,并人滤液中,加水稀释至刻度,混匀。
(5)步骤:准确移取100ml滤液置于另一锥形瓶中,加入8ml 6mol/L氨水和2ml 5%碘化钾溶液,混匀,在黑色背景衬托下,用微量滴定管以硝酸银标准工作液滴定至出现混浊时为终点,记录硝酸银标准工作液消耗体积。
  在和试样测定相同的条件下,做试剂空白试验,用硝酸银标准工作液滴定,记录其消耗体积(参见中华人民共和国国家标准GB/T13084-1991)。
  (五)饲料中亚硝酸盐含量的测定

  1.原理 样品在微碱性条件下除去蛋白质,在酸性条件下试样中的亚硝酸盐与对氨基苯磺酸反应,生成重氨化合物,再与氮-1-萘乙二胺盐酸盐偶合形成红色物质,进行比色测定。
  2.测定
  (1)亚硝酸钠标准贮备液:称取经(115±5)℃烘至恒重的亚硝酸钠0.3g,用水溶解后,移人于500ml容量瓶中,加水稀释至刻度,此溶液每毫升相当于400μg亚硝酸根离子。
  亚硝酸钠标准工作液:吸取5ml亚硝酸钠标准贮备液于200 ml容量瓶中,加水稀释至刻度,此溶液每毫升相当于10μg亚硝酸根离子。
  (2)试液制备:称取约5g试样,精确到0.001g,置于200ml烧杯中,加约70ml温水[(60±5)℃]和5ml四硼酸钠饱和溶液,在水浴上加热15min[(85±5)℃],取出,稍冷却,依次加入2ml 10.6%的亚铁氰化钾溶液、2ml 22%的乙酸锌溶液,每一步需充分搅拌,将烧杯内溶液全部转移至150ml容量瓶中,用水洗涤烧杯数次,并人容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,静置澄清,用滤纸过滤,滤液为试液备用。
  (3)步骤:准确吸取试液约30ml,置于50ml棕色容量瓶中,依次加入2ml 0.5%对氨基苯磺酸溶液、2ml盐酸溶液,混匀,在闭光处放置3~5min,加入2m1 0.1% 氮-1-萘基苯磺酸溶液,加水稀释至刻度,混匀,在闭光处放置15min,以0ml亚硝酸钠标准工作液为参比,在波长538nm处,用分光光度计测其溶液的吸光度(参见中华人民共和国国家标准GB/T13085-1991)。
负责人熊本海博士



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