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日期20020613名称次生性有毒有害物质的检验
副类别饲料中有毒有害物质的检验类别饲料质量检验
资料来源中国饲料数据库情报网中心
内容正文 次生性有毒有害物质的检验
(一)饲料中黄曲霉毒素B1的检验
1.原理样品中黄曲霉毒素B1 (aflatoxin B1)经提取、柱层析、洗脱、浓缩、薄层分离后,在波长365nm紫外灯光下产生蓝紫色荧光,根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。 2.操作要点 (1)取20g制备样品,置锥形磨口烧瓶中;加硅藻土10g、水10ml、三氯甲烷100ml,加塞在振荡器上振荡30min,用滤纸过滤,滤液至少50ml,定容。 (2)移取滤液,加正己烷混匀,转移至硅胶层析柱中,纯化,再用三氯甲烷一甲醇液洗脱,用旋转蒸发器烧瓶收集全部洗脱液,在50℃下减压蒸馏。 (3)用苯一乙氯混合液定量转移残留物到刻度试管,经50℃以下水浴,浓缩至20ml,用薄层法点样层折。 (4)与标准黄曲霉样液在紫外光下观察对比荧光强度(参见中华人民共和国国家标准GB/T8381-1987)。 (二)饲料中霉菌总数的检验
1.原理根据霉菌(molde)生理特性,选择适宜于霉菌生长而不适宜于细菌生长的培养基,采用平皿计数方法,测定霉菌总数。 2.检验程序见饲料中霉菌总数的检验程序图(参见中华人民共和国国家标准GB/T13092-1991)。
饲料中霉菌总数的检验程序
(三)霉菌毒素分析的一般程序
1.提取大多数霉菌毒素都易溶于有机溶剂,在水中的溶解度较低,但加入少量水往往有利于提高提取效率。通常根据被提取对象的极性,选择2种或多种溶剂混合提取,常用的极性溶剂有甲醇、丙酮和乙腈等,疏水溶剂有氯仿和二氯甲烷等,提取过程中一般要辅助以搅拌、振荡等机械手段。提取后一般要进行脱脂。AOAC手册、国际标准化组织(ISO)和欧共体(EEC)有关饲料分析的出版物中均有推荐的提取方法。 2.过滤为获得澄清的提取液,有时还需加入硅藻土等助虑剂,但加入的助虑剂对所要提取的毒素不能有吸附作用,有时也可用离心代替。 3.净化净化的目的是除去提取液中干扰测定的成分,常见的有透析、色谱和分液等方法。其中色谱柱法可根据具体要求选择适当的固定相,常见的有硅胶、硅藻土、木炭、聚酰胺、葡聚糖和离子交换树脂等,因而实用范围最广,但应选择合适的洗脱溶剂系统。 4.浓缩一般用常压或减压蒸馏法脱去溶剂,为防止氧化有时需要用氮气保护。 5.检测和定量薄层色谱(Thin Layer chromatography TLC)和柱色谱(Column Chromatogrphy)法是最常用的定性和定量检测方法。与净化时的色谱法相同,也可根据具体要求选择适当的固定相,有简便、快速、分析费用低等特点。近年来,用高压液相色谱(High Pressure Liquid Chromatography HPLC)获得了较好的结果,与TLC相比,HPLC可以降低提取液组分间的相互干扰,同时区分和定量多种毒素,但需要昂贵的仪器和高水平的技术人员。用气相色谱(GasChromatography)的分析方法较少。这里只介绍TLC法。 (1)薄板:除有特殊要求,现在一般用通用商品薄板,自制薄板需经与标准板校正后方可使用。检测无荧光物质必须选用有荧光指示剂的薄板,反之亦然,以降低干扰。硅胶板有时需加入乙二胺四乙酸(EDTA)、草酸、十二烷基磺酸钠(SDS)或羧甲基纤维素(CMC)等以提高分析效果。 (2)流动相与Rf值:流动相(层析液)的选择不一定要死板套用前人报道的配方,应根据所分离的毒素性质调节极性和非极性溶剂的比例,或调节洗脱剂的离子强度,以获得最佳分离效果。理想的流动相Rf值应在0.6~0.9之间。层析液若无挥发性可重复利用,但每次新配制时各种成分之间的比例必须一致,否则会影响不同批次间RI值的稳定。此外,层析槽内的气压、大气湿度以及薄板在层析槽中的准确位置都会影响Rf值,操作时要求在展开之前,将薄板的吸附剂层对着展开剂,密闭饱和一段时间,以提高Rf值的稳定性。由于影响Rf的变因很多,一般的分析,方法不列Rf值。 (3)点样:为准确定量,一般要用带齐头针头的微量注射器,样斑越小越好,最大不得大于2mm。待测样品一般居中,标准样品按含量由低到高分别位于两侧,点样后应作好标记。 (4)定量:利用有的霉菌毒素在紫外光区有吸收峰,或在紫外光下可激发荧光,或能与某种色原物质发生特异的成色反应的特点,常用比色法进行定性和定量分析。以前一般采用目视比色法定量,现在可借助紫外分光光度计或荧光光度计定量,避免目视比色的检测范围小和人为干扰等缺陷。为消除干扰,也可采用更换流动相进行2次展开、二维展开,展开后喷洒显色剂或对待测物进行衍生等技术。
负责人熊本海博士



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